Wnt10b-DKK1-Gsdma3在毛囊周期中調(diào)控毛囊大小的作用與機(jī)制研究.pdf

1、根據(jù)形態(tài)學(xué)和細(xì)胞水平及分子水平上的行為的不同，毛囊的周期可以分為三個(gè)不同的階段：生長(zhǎng)期(Anagen)、退化期(Catagen)以及靜止期(Telogen)[1-4]。毛囊在一個(gè)周期的不同時(shí)期中，體現(xiàn)著其特定的大小，包括不同的直徑和長(zhǎng)度。毛囊在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中如何決定其直徑和長(zhǎng)度目前還不清楚。
　　毛囊的直徑受控于DP的大小。我們推測(cè)Wnt10b/DKK1可能通過(guò)調(diào)節(jié)DP與表皮細(xì)胞的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)毛囊的直徑。本研究中，我們首先通過(guò)對(duì)

2、靜止期不應(yīng)期（refractory telogen）的C57BL/6小鼠背皮多次過(guò)表達(dá)腺病毒介導(dǎo)的Wnt10b，激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路。通過(guò)H&E染色，檢測(cè)再生毛囊的形態(tài)變化。對(duì)過(guò)表達(dá)Wnt10b后的再生毛囊的種類進(jìn)行分析，觀察Wnt10b對(duì)于再生毛囊種類改變的影響。為探討Wnt10b如何在細(xì)胞和分子水平上改變?cè)偕业男螒B(tài)，我們用免疫熒光檢測(cè)和比較了再生毛囊其干細(xì)胞、增殖、分化水平的變化。其次，我們?cè)谶^(guò)表達(dá)Wnt1

3、0b后，繼續(xù)過(guò)表達(dá)DKK1，檢測(cè)DKK1對(duì)Wnt信號(hào)通路抑制之后，毛囊大小的變化情況。再次，我們對(duì)小鼠背皮生長(zhǎng)期毛囊直接過(guò)表達(dá)DKK1，檢測(cè)其對(duì)毛囊大小控制的直接作用。
　　毛囊的長(zhǎng)度決定于生長(zhǎng)期的長(zhǎng)短。此外，先前的研究表明，Gsdma3可能影響毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育。我們推測(cè)Gsdma3可能影響毛囊的長(zhǎng)度。我們檢測(cè)了Gsdma3基因突小鼠背皮毛囊的形態(tài)，以及Gsdma3基因突變后Wnt/β-catenin的表達(dá)情況，以探討Gsdma3與

4、毛囊Wnt信號(hào)通路相互作用。再次，我們用TUNEL染色和免疫熒光、RT-PCR、Western blot等技術(shù)檢測(cè)凋亡信號(hào)通路的關(guān)鍵分子Caspase-3的表達(dá)，來(lái)觀察Gsdma3對(duì)毛囊內(nèi)外根鞘凋亡的影響。我們通過(guò)對(duì)野生型小鼠和Gsdma3基因突變鼠過(guò)表達(dá)Gsdma3，來(lái)確認(rèn)Gsdma3對(duì)于毛囊形態(tài)學(xué)的控制。在離體水平上，我們對(duì)JB6細(xì)胞過(guò)表達(dá)Gsdma3，觀察Gsdma3對(duì)表皮細(xì)胞凋亡的影響。
　　過(guò)度的Wnt激活誘使新的毛囊的

5、生長(zhǎng)。我們推測(cè)Wnt10b/DKK1參與新生物的生長(zhǎng)發(fā)育。我們?cè)陔x體水平上，對(duì) JB6細(xì)胞持續(xù)過(guò)表達(dá) Wnt10b或者連續(xù)性表達(dá)Wnt10b/DKK1，觀察皮膚細(xì)胞的遷移，增殖和侵襲能力的變化，在細(xì)胞和分子水平上鑒定Wnt10b/DKK1對(duì)于表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用。
　　主要結(jié)果如下：
　?、?Wnt10b/DKK1調(diào)控毛囊的直徑：
　　檢測(cè)了4次Wnt10b過(guò)表達(dá)后，小鼠再生毛囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。在多次過(guò)表達(dá)Wnt1

6、0b誘導(dǎo)再生的毛囊中，其各部分結(jié)構(gòu)明顯增寬增粗，如毛球部、內(nèi)外根鞘、毛干髓質(zhì)等毛囊的結(jié)構(gòu)都明顯增寬，而毛乳頭也明顯增大，這些結(jié)構(gòu)的增大增寬共同導(dǎo)致了整個(gè)毛囊結(jié)構(gòu)的增寬，說(shuō)明Wnt10b在毛囊再生過(guò)程中對(duì)毛囊直徑具有調(diào)節(jié)作用。Wnt10b誘導(dǎo)再生的毛囊，其長(zhǎng)度沒(méi)有明顯變化。有趣的是，在影響的毛囊類型中，Wnt10b更多的作用于Zigzag毛囊，而對(duì)其他種類的毛囊作用較小，也并未顯著改變毛囊的種類。檢測(cè)了再生毛囊的增殖、分化情況和毛囊干細(xì)胞

7、的定位。在Wnt10b多次誘導(dǎo)再生的毛囊，Wnt信號(hào)通路過(guò)度激活，其各部分的增殖明顯加劇，內(nèi)根鞘和毛干的分化紊亂，而毛囊干細(xì)胞的標(biāo)記物高表達(dá)于非bulge區(qū)的外根鞘部位。在2次過(guò)表達(dá)Wnt10b之后繼續(xù)過(guò)表達(dá)DKK1，大部分的毛囊可維持正毛囊常P98的大小，其毛母質(zhì)、外根鞘、DP的增殖能力恢復(fù)到正常水平，而外根鞘的毛囊干細(xì)胞標(biāo)記物表現(xiàn)明顯降低，但其內(nèi)根鞘和毛干的分化水平無(wú)法完全恢復(fù)。一次劑量DKK1處理生長(zhǎng)期早期毛囊，可顯著減小次級(jí)毛囊

8、毛干的直徑。
　?、?Gsdma3調(diào)控毛囊的長(zhǎng)度：
　　H&E染色顯示，Gsdma3基因突變鼠的毛囊間表皮和毛囊漏斗部明顯增厚，毛囊的長(zhǎng)度在生長(zhǎng)期稍顯增長(zhǎng)但與野生型小鼠毛囊相比無(wú)顯著差異。但在野生型小鼠進(jìn)入退化期毛囊長(zhǎng)度縮短時(shí)，Gsdma3基因突變鼠的毛囊依舊維持生長(zhǎng)期的長(zhǎng)度。免疫熒光、RT-PCR和Western blot結(jié)果表明，β-catenin在Gsdma3基因突變鼠毛囊間表皮和漏斗部表達(dá)明顯升高，而Caspase-

9、3在Gsdma3基因突變鼠的內(nèi)外根鞘表達(dá)明顯降低。TUNEL染色顯示在毛囊退化期，Gsdma3基因突變鼠的內(nèi)外根鞘細(xì)胞凋亡程度明顯下降。TNF-a誘導(dǎo)C57BL/6鼠和Gsdma3突變鼠后，TNFR2和Gsdma3表達(dá)明顯升高，而凋亡跡象僅在B6鼠發(fā)生，在Gsdma3突變鼠受阻。在對(duì) Gsdma3基因突變鼠和野生型小鼠背皮過(guò)表達(dá) Gsdma3后，毛囊長(zhǎng)度明顯縮短，內(nèi)外根鞘TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增加，Caspase-3表達(dá)明顯升高。在

10、離體水平上對(duì)JB6細(xì)胞過(guò)表達(dá)Gsdma3后，亦印證了在體水平Gsdma3促進(jìn)上皮細(xì)胞凋亡的作用。
　?、?Wnt10b/DKK1控制表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)型：
　　通過(guò)對(duì)JB6細(xì)胞2次過(guò)表達(dá)Wnt10b，經(jīng)典Wnt信號(hào)激活，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯增加。在多次過(guò)表達(dá)Wnt10b后，JB6細(xì)胞轉(zhuǎn)化為細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)結(jié)構(gòu)。而順序性過(guò)表達(dá)Wnt10b+DKK1，可阻斷Wnt信號(hào)通路的激活，并抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，阻止表皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化