山羊毛囊細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定及毛囊體外重塑研究.pdf

1、以濟(jì)寧青山羊?yàn)閯?dòng)物模型，從毛囊細(xì)胞體外分離培養(yǎng)和體外毛囊重建研究角度闡明毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律、影響因素及毛囊真皮與表皮細(xì)胞的互作機(jī)制，不僅可為提高山羊毛絨產(chǎn)量和品質(zhì)的育種改良奠定基礎(chǔ);還可為加速提高毛絨品質(zhì)、數(shù)量和揭示毛發(fā)再生機(jī)理乃至醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的人類毛發(fā)研究等提供借鑒。毛囊細(xì)胞體外分離培養(yǎng)技術(shù)的完善，體外重塑毛囊模型的建立，可為研究毛囊生長(zhǎng)與分化機(jī)制，相關(guān)細(xì)胞因子對(duì)皮膚毛囊細(xì)胞損傷修復(fù)的作用機(jī)理，尤其是哺乳動(dòng)物毛纖維形成機(jī)制提供良好模型，也

2、是研究相關(guān)細(xì)胞因子以及激素對(duì)毛囊發(fā)育、羊毛品質(zhì)和黑色素形成與調(diào)控機(jī)理的基礎(chǔ)。本研究在成功構(gòu)建了多種山羊皮膚毛囊細(xì)胞體外分離培養(yǎng)鑒定技術(shù)平臺(tái)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了適宜的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)體系，成功構(gòu)建了毛囊體外重塑模型與毛纖維體外生成體系，可為進(jìn)一步深入研究毛囊分化與發(fā)育的影響因素及其所涉及到的一系列生理現(xiàn)象，如皮膚毛囊細(xì)胞分化、真皮和表皮細(xì)胞間的互作、皮膚毛囊損傷和被清理機(jī)制等研究奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容、方法和結(jié)果如下:
　　 一、山羊毛

3、囊外根鞘細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化
　　 無菌分離活體青山羊羔羊的次級(jí)毛囊，采用機(jī)械分離與酶消化相結(jié)合的方法，分離純一的毛囊外根鞘細(xì)胞(ORSC)，培養(yǎng)于含有表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、類胰島素生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)和氫化可的松(hydrocortisone)的無血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中，置5％CO2濃度的37℃培養(yǎng)箱中啟動(dòng)原代培養(yǎng)。待原代細(xì)胞長(zhǎng)成良好的單層后即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)至8～10代時(shí)，更換含EGF、IGF-Ⅰ、氫化

4、可的松和2％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)，更換培養(yǎng)液后可見細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)逐漸趨于穩(wěn)定。選取穩(wěn)定傳代的ORSC進(jìn)行生物學(xué)特性研究與鑒定。結(jié)果表明:該細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為51.9h;培養(yǎng)細(xì)胞的染色體數(shù)仍以2n=60為主，細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定結(jié)果表明，外根鞘細(xì)胞角蛋白19表達(dá)呈陽性，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)的細(xì)胞確為由毛囊干細(xì)胞分化來的外根鞘細(xì)胞。
　　 二、山羊毛乳頭細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定
　　 將中性蛋白酶與膠原酶消化及預(yù)

5、鋪設(shè)促貼壁培養(yǎng)基質(zhì)相結(jié)合，分離并純化山羊DPC，培養(yǎng)于含有表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，放入37℃CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)。待原代細(xì)胞長(zhǎng)至完全匯合并進(jìn)行傳代培養(yǎng)后，更換含EGF、bFGF和2％FBS的MEM與DMEM/F12(1∶1)復(fù)合培養(yǎng)液繼續(xù)傳代培養(yǎng)，更換培養(yǎng)液后可見細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)逐漸趨于穩(wěn)定。選取穩(wěn)定傳至第7代的DPC進(jìn)行生物學(xué)特性研究與鑒定。結(jié)果表明:該細(xì)胞

6、的平均克隆形成率為60％，細(xì)胞增殖活力旺盛;培養(yǎng)細(xì)胞的染色體數(shù)仍以2n=60為主，細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果表明，體外培養(yǎng)的DPCα-SMA和Vimentin表達(dá)均呈陽性，充分證實(shí)本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)的細(xì)胞確為毛囊真皮源性的毛乳頭細(xì)胞。
　　 三、山羊真皮成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其細(xì)胞系的建立
　　 利用中性蛋白酶(dispase)4℃冷消化法分離皮膚的表皮層和真皮層，以利于純化培養(yǎng)真皮成纖維細(xì)胞。然后，采用原代外植與酶消化相結(jié)合的方

7、法，分離純化的DFB:即先利用Dispase酶分離皮膚表、真皮層后，剪切真皮部分成組織小塊，再對(duì)小組織塊進(jìn)行酶（胰蛋白酶）消化處理，隨即將真皮外植塊接種于6孔培養(yǎng)板底壁上。待貼牢后添加含有堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、青霉素、鏈霉素、泰樂菌素(tylosin)和10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，置5％CO2濃度的37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中啟動(dòng)原代培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)板中的真皮

8、外植塊遷移出大量細(xì)胞時(shí)（約5～6天），換為含有bFGF、青霉素、鏈霉素、泰樂菌素(tylosin)和5％FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，每3天更換1次培養(yǎng)液。待原代真皮成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合時(shí)，進(jìn)行傳代，并于第一次傳代時(shí)更換為25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，以利于真皮成纖維細(xì)胞在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)與凍存。本研究所建立的DFB細(xì)胞系已經(jīng)穩(wěn)定傳至56代以上，其生長(zhǎng)分裂狀態(tài)良好，細(xì)胞遺傳性狀穩(wěn)定。
　　 四、山羊體外重塑毛囊模型的建立和維持<

9、br>　　 在無菌冰浴條件下，將鼠尾膠原、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素A按比例依次混合到MEM與DMEM/F12(1∶1)復(fù)合培養(yǎng)液中，制成凝膠。調(diào)節(jié)pH后加入24孔板中。收獲前期分離培養(yǎng)與鑒定的純化毛乳頭、真皮成纖維細(xì)胞，用含EGF、bFGF和5％FBS的MEM與DMEM/F12(1∶1)混合培養(yǎng)液制成細(xì)胞混懸液，用無菌吸管將細(xì)胞混懸液加入24孔板中，待其在常溫下形成真皮細(xì)胞膠原凝膠后，置于37℃、5％CO2的飽和濕度環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。每天在

10、顯微鏡下觀察DPC與DFB的生長(zhǎng)增殖情況。待毛囊真皮細(xì)胞達(dá)到完全匯合后，表面覆蓋預(yù)先制備的ORSC細(xì)胞混懸液，繼續(xù)培養(yǎng)3～5天，觀察ORSC于毛囊真皮細(xì)胞膠原凝膠上形成完整單層后，去除舊的培養(yǎng)液，加入少量（恰好覆蓋表面ORSC細(xì)胞即可）含IGF-Ⅰ、EGF的無血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2的飽和濕度環(huán)境中進(jìn)行氣-液界面培養(yǎng)，每?jī)商旄鼡Q一次表層培養(yǎng)基。經(jīng)顯微觀察拍攝、測(cè)微尺測(cè)量與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，在進(jìn)行氣液界面培

11、養(yǎng)初期，毛乳頭細(xì)胞即呈現(xiàn)凝集性生長(zhǎng)趨勢(shì)，而表面的毛囊外根鞘細(xì)胞亦呈集落樣散在分布于真皮成纖維細(xì)胞層中。隨著氣液界面培養(yǎng)的進(jìn)行，毛乳頭細(xì)胞進(jìn)一步凝集性生長(zhǎng)，部分外根鞘細(xì)胞集落通過凝膠中的真皮成纖維細(xì)胞單層遷移聚集在毛乳頭細(xì)胞團(tuán)周圍，并不斷包繞，分化形成圓球樣的類毛球結(jié)構(gòu)貼附在真皮成纖維細(xì)胞層上。約經(jīng)過10天的體外培養(yǎng)，由幾種毛囊細(xì)胞形成的圓球狀結(jié)構(gòu)逐漸向外圍拉伸擴(kuò)張，內(nèi)部的毛乳頭細(xì)胞向一端遷移生長(zhǎng)，最終由毛球樣結(jié)構(gòu)伸展延長(zhǎng)成類毛囊結(jié)構(gòu)，并

12、有毛纖維從基部長(zhǎng)出，部分生長(zhǎng)出的毛纖維顏色為濃黑色，內(nèi)含黑色素。各檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，體外重建的毛囊結(jié)構(gòu)與體內(nèi)正常毛囊比較無論在組織結(jié)構(gòu)、毛纖維生長(zhǎng)速度，還是毛囊發(fā)育關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控方面，均差異不顯著。
　　 本研究?jī)?yōu)化并建立了山羊毛囊細(xì)胞體外培養(yǎng)條件和體系，研究了細(xì)胞因子對(duì)毛囊真皮表皮細(xì)胞的影響，成功建立了山羊毛囊體外誘導(dǎo)重建體系，為揭示山羊毛囊分化發(fā)育與羊毛生長(zhǎng)的影響因素和調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)和提供了模型;并為醫(yī)學(xué)研究和發(fā)現(xiàn)毛發(fā)疾