Wnt10b在毛囊周期調(diào)控中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　 毛囊是具有周期性生長(zhǎng)特性的一個(gè)特殊器官，毛囊周期分為生長(zhǎng)期、退化期和靜止期。在靜止期，毛囊細(xì)胞受到某些因素的刺激，會(huì)再次進(jìn)入生長(zhǎng)期，如此周而復(fù)始在哺乳動(dòng)物的整個(gè)生命期間循環(huán)往復(fù)。毛囊經(jīng)歷生長(zhǎng)期、退化期、靜止期循環(huán)后再次進(jìn)入生長(zhǎng)期的過(guò)程稱(chēng)為毛囊周期性再生。由于毛囊具有周期性生長(zhǎng)的特性，為組織再生研究提供了一個(gè)非常好的模型。如果毛囊各周期轉(zhuǎn)換中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，就可能會(huì)影響毛囊的生長(zhǎng)，進(jìn)而出現(xiàn)毛囊相關(guān)疾病，例如脫

2、發(fā)、斑禿等。而斑禿等的治療在機(jī)制研究和臨床研究上還存在諸多問(wèn)題，如容易復(fù)發(fā)等。
　　 因此，毛囊周期的調(diào)控就顯得至關(guān)重要，毛囊周期由毛囊干細(xì)胞介導(dǎo)發(fā)生。毛囊干細(xì)胞的激活和靜息受到多種信號(hào)通路的調(diào)控，包括Wnt信號(hào)通路、BMP信號(hào)通路、FGF信號(hào)通路、Shh信號(hào)通路等。Wnt信號(hào)通路廣受關(guān)注，它分為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，在毛囊的發(fā)育和周期性再生中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路研究較多，在經(jīng)典Wnt信號(hào)

3、通路的各個(gè)重要環(huán)節(jié)進(jìn)行阻斷，均會(huì)嚴(yán)重影響毛囊的生成。激活Wnt信號(hào)通路的Wnt蛋白有19種，但在毛囊周期性再生中，哪種或哪幾種發(fā)揮關(guān)鍵作用，還不得而知。作者通過(guò)文獻(xiàn)篩選，發(fā)現(xiàn)Wnt10b在皮膚附件發(fā)育時(shí)具有最明顯的限制性表達(dá)，即特異性地表達(dá)于毛囊發(fā)育早期的基板。而毛囊的周期性再生過(guò)程與毛囊發(fā)育具有相似性，因此，作者推測(cè)Wnt10b在毛囊周期調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。
　　 目的與意義：
　　 本課題擬研究Wnt10b在毛囊周

4、期調(diào)控中發(fā)揮的具體作用，并探討其作用機(jī)制。為研究基于Wnt蛋白的治療毛囊周期性再生障礙相關(guān)疾病的藥物提供基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：
　　 1.Wnt10b在毛囊周期中的表達(dá)觀察①用免疫組化的方法觀察Wnt10b蛋白在小鼠生后正常周期毛囊中的表達(dá)特性，并采用免疫印跡方法對(duì)小鼠各周期中皮膚全層Wnt10b的表達(dá)進(jìn)行半定量分析；
　　 ②制備地高辛標(biāo)記的Wnt10b RNA探針，觀察Wnt10bmRNA在小鼠生后正常周

5、期毛囊中的表達(dá)狀況，并采用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法對(duì)小鼠各周期中皮膚全層Wnt10b的mRNA表達(dá)進(jìn)行半定量分析。
　　 2.Wnt10b對(duì)毛囊的作用研究①利用HEK-293細(xì)胞擴(kuò)增，CsCl 超速離心純化AdWnt10b，驗(yàn)證腺病毒介導(dǎo)目的基因的生物學(xué)活性；
　　 ②解剖顯微鏡分離觸須毛囊，建立器官培養(yǎng)模型，并通過(guò)熒光染色對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，然后用AdWnt10b 處理培養(yǎng)毛囊，離體觀察Wnt10b對(duì)毛囊的影響；
　　

6、③在小鼠背部皮內(nèi)注射腺病毒，并通過(guò)直接觀察熒光、X-gAl染色等方法對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，然后在不同時(shí)相點(diǎn)注射AdWnt10b，在體觀察Wnt10b對(duì)毛囊的影響。
　　 3.Wnt10b的信號(hào)通路研究①用免疫組化檢測(cè)正常毛囊周期中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子Frizzled、Lef1、TCF3的蛋白表達(dá)，并分別通過(guò)原位雜交和免疫組化對(duì)β-catenin的原位mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，與Wnt10b的表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)一步利用

7、PCR array 技術(shù)，檢測(cè)毛囊不同周期Wnt信號(hào)分子間的表達(dá)差異；
　　 ②在毛囊器官培養(yǎng)模型上，利用腺病毒載體從細(xì)胞膜受體水平、細(xì)胞漿水平和細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄水平分別阻斷經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子后，觀察其對(duì)AdWnt10b 誘導(dǎo)毛干生長(zhǎng)作用的影響；
　　 ③靜止期小鼠拔毛誘導(dǎo)毛囊生長(zhǎng)，然后利用腺病毒載體從細(xì)胞膜受體水平、細(xì)胞漿水平和細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄水平分別阻斷經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，觀察毛囊生長(zhǎng)情況；
　　 在

8、以上各在體動(dòng)物注射模型上，利用腺病毒介導(dǎo)的β-catenin 干擾序列干擾經(jīng)典Wnt信號(hào)通路后，觀察其對(duì)Wnt10b 誘導(dǎo)毛囊周期性再生作用的影響。
　　 4.Wnt10b在毛囊周期中的作用機(jī)制研究①通過(guò)BrdU 標(biāo)記檢測(cè)Wnt10b 誘導(dǎo)后不同時(shí)相點(diǎn)皮膚及毛囊細(xì)胞的增殖情況；
　　 ②通過(guò)免疫熒光和免疫印跡研究Wnt10b在JB6細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)后對(duì)細(xì)胞分化的影響。
　　 結(jié)果與討論：
　　 1.Wnt1

9、0b表達(dá)與毛囊周期具有時(shí)空相關(guān)性Wnt10b蛋白和mRNA在靜止期無(wú)表達(dá)，在退化期的近心端（靠近真皮一端）內(nèi)外根鞘有弱表達(dá)，在生長(zhǎng)期的毛母質(zhì)強(qiáng)表達(dá)，生長(zhǎng)期的內(nèi)外根鞘及前體細(xì)胞也有表達(dá)。說(shuō)明Wnt10b與毛囊周期密切相關(guān)，可能在毛囊的周期性再生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
　　 2.Wnt10b能夠誘導(dǎo)毛囊周期性再生本實(shí)驗(yàn)所擴(kuò)增的腺病毒具有生物學(xué)活性；研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)AdWnt10b 處理的器官培養(yǎng)毛囊，其毛干生長(zhǎng)的速度明顯比對(duì)照組快，此離體

10、說(shuō)明Wnt10b對(duì)毛囊生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；用AdWnt10b 注射小鼠背皮后，能夠在注射部位觀察到綠色熒光，說(shuō)明該腺病毒能夠用于在體皮內(nèi)注射；注射AdWnt10b后，生長(zhǎng)期和退化期的毛囊無(wú)變化，而靜止期毛囊提前進(jìn)入生長(zhǎng)期，此在體說(shuō)明Wnt10b能誘導(dǎo)毛囊周期性再生。
　　 3.Wnt10b 經(jīng)由經(jīng)典Wnt信號(hào)通路發(fā)揮誘導(dǎo)毛囊周期性再生作用檢測(cè)正常毛囊周期中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中關(guān)鍵分子Frizzled、Lef1、TCF3的蛋白表達(dá)，并

11、對(duì)β-catenin的原位mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們與Wnt10b的表達(dá)相關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步通過(guò)PCR array分析也發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)期的經(jīng)典Wnt信號(hào)分子顯著高于靜止期和退化期；在毛囊器官培養(yǎng)模型上，阻斷經(jīng)典Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子后，能夠阻斷AdWnt10b 誘導(dǎo)毛干生長(zhǎng)的作用，此離體研究說(shuō)明Wnt10b 經(jīng)由經(jīng)典Wnt信號(hào)通路促進(jìn)毛干生長(zhǎng)；在體動(dòng)物注射模型上，干擾經(jīng)典Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子β-catenin后，能夠阻斷AdWnt10

12、b 誘導(dǎo)毛囊周期性再生的作用，此在體研究說(shuō)明Wnt10b 經(jīng)由經(jīng)典Wnt信號(hào)通路誘導(dǎo)毛囊的周期性再生。
　　 4.Wnt10b 可能通過(guò)誘導(dǎo)表皮基底層細(xì)胞增殖、分化而啟動(dòng)毛囊周期性再生BrdU 標(biāo)記檢測(cè)增殖發(fā)現(xiàn)Wnt10b 誘導(dǎo)后24h，表皮基底層細(xì)胞最先發(fā)生增殖，然后全層皮膚和毛囊細(xì)胞發(fā)生增殖。提示W(wǎng)nt10b 可能通過(guò)直接或間接作用于表皮基底層細(xì)胞，來(lái)發(fā)揮誘導(dǎo)毛囊周期性再生的作用；Wnt10b 誘導(dǎo)表皮基底層細(xì)胞表達(dá)毛囊結(jié)構(gòu)