Wnt10b調(diào)控人毛囊生長(zhǎng)的分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　 毛囊是人體內(nèi)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞成份最復(fù)雜的微小器官，其主要功能是形成毛發(fā)組織。胚胎時(shí)期毛囊的發(fā)育是神經(jīng)外胚層-中胚層之間相互作用的結(jié)果，主要有三種類型的干細(xì)胞作用:上皮、神經(jīng)脊、間充質(zhì)。根據(jù)干細(xì)胞的來源，分別分化為上皮系（皮脂腺、分化為內(nèi)外根鞘細(xì)胞和毛發(fā)細(xì)胞的毛母質(zhì)角質(zhì)細(xì)胞），間充質(zhì)系（具有誘導(dǎo)功能的毛乳頭細(xì)胞，毛囊結(jié)締組織鞘），而神經(jīng)脊細(xì)胞則分化形成能夠產(chǎn)生毛囊色素單位的黑色素細(xì)胞。
　　 許多實(shí)驗(yàn)研究顯示:成人

2、毛囊生長(zhǎng)的過程與胚胎時(shí)期毛囊發(fā)育的形態(tài)發(fā)生非常相似，參與胚胎毛囊發(fā)育的許多分子信號(hào)、細(xì)胞因子等在成人毛囊的周期性生長(zhǎng)過程中同樣具有明顯的表達(dá)，誘導(dǎo)胚胎時(shí)期毛囊形態(tài)發(fā)生的信號(hào)很可能與促進(jìn)成人毛囊干細(xì)胞向毛囊上皮分化的信號(hào)相一致。因此，對(duì)毛囊的形態(tài)發(fā)生與發(fā)育信號(hào)通路的研究，尤其是了解這些信號(hào)通路對(duì)于成人毛囊周期性生長(zhǎng)調(diào)控的分子機(jī)制，有助于開發(fā)促進(jìn)或者抑制毛發(fā)生長(zhǎng)的相關(guān)藥物的研究，從而更快更有效地治療脫發(fā)等相關(guān)的毛發(fā)疾病。
　　 在胚

3、胎發(fā)育期間，毛囊的形態(tài)發(fā)生和發(fā)育依賴于真皮和表皮之間一系列信號(hào)分子的調(diào)控，它們介導(dǎo)了兩個(gè)不同的細(xì)胞群體之間的相互作用，誘導(dǎo)兩種細(xì)胞進(jìn)行有序的增殖和特定的分化，并引導(dǎo)細(xì)胞最終分化形成內(nèi)根鞘、外根鞘、毛干，以及毛乳頭。這些信號(hào)主要包括了Wnt/Wingless家族、SonicHedgehog(Shh)，以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGF-β2)、骨形成蛋白家族(BMPs)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族(FGFs)、外胚葉發(fā)育不全基因（Eda/Edar）

4、等。其中，已經(jīng)有許多實(shí)驗(yàn)研究通過基因敲除和轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物模型證實(shí)Wnt信號(hào)是促進(jìn)毛囊發(fā)育的關(guān)鍵因素。
　　 Wnt家族蛋白與果蠅Wingless蛋白同源，是一類脂質(zhì)修飾的分泌型糖蛋白家族，通過激活細(xì)胞表面的受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來調(diào)控各種細(xì)胞功能作用，例如細(xì)胞分化的方向、增殖、遷移、極性分布，以及基因的表達(dá)。Wnt蛋白不但對(duì)胚胎時(shí)期的形態(tài)發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，而且參與多種成體組織的再生，如皮膚和毛囊組織。當(dāng)Wnt蛋白位于細(xì)胞表面

5、的受體卷曲蛋白(FZ)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6受體（LRP5/6）家族成員相結(jié)合時(shí)，能夠激活Wnt經(jīng)典的信號(hào)通路。在經(jīng)典的Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路中，卷曲蛋白能夠作用于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蓬亂蛋白(Dishevelled，DVL)，蓬亂蛋白能夠切斷位于細(xì)胞質(zhì)的β-catenin的降解途徑，從而促使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積累，并進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子(T cell factor/lymphoi

6、d enhancer factor，TCF/LEF-1)相互作用;而當(dāng)Wnt信號(hào)不存在時(shí)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin很快就被降解。Wnt蛋白通過調(diào)控TCF/LEF-1來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，對(duì)多種靶細(xì)胞和組織發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Wnt信號(hào)決定了未分化表皮細(xì)胞的命運(yùn)，研究表明在轉(zhuǎn)基因小鼠中，當(dāng)表皮細(xì)胞過表達(dá)Wnt信號(hào)的抑制劑Dickkopf1(Dkk1)，或者表皮細(xì)胞缺少β-catenin時(shí)，結(jié)果抑制了毛囊的發(fā)育形成;然而，當(dāng)表皮細(xì)胞過表達(dá)

7、β-catenin時(shí)，毛囊發(fā)育異常增多。此外，Wnt信號(hào)對(duì)出生后毛囊毛干的形成亦起到重要的調(diào)控作用，據(jù)Millar et.al研究結(jié)果表明Wnt3和DVL2在小鼠的毛干前體細(xì)胞有明顯的表達(dá)，當(dāng)在毛囊的外根鞘中異位表達(dá)Wnt3時(shí)則導(dǎo)致毛干前體細(xì)胞不能成功地分化形成毛干。Kishimoto et.al證實(shí)新鮮分離的小鼠毛囊毛乳頭細(xì)胞能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞形成新生毛囊，但是將毛乳頭細(xì)胞在體外進(jìn)行傳代培養(yǎng)過程中，細(xì)胞逐漸喪失誘導(dǎo)毛囊在生的能力。但是經(jīng)

8、典的Wnt信號(hào)能夠維持體外培養(yǎng)的小鼠毛乳頭細(xì)胞的誘導(dǎo)能力，說明可能在體內(nèi)毛囊上皮細(xì)胞的Wnt信號(hào)能夠作用于毛乳頭，從而維持毛乳頭細(xì)胞的誘導(dǎo)能力。但是人和小鼠的Wnt家族成員總共達(dá)到19種之多，究竟是何種Wnt蛋白成員對(duì)出生后的人毛囊生長(zhǎng)發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用，而其發(fā)揮作用的調(diào)控機(jī)制是什么迄今為止尚不明確。
　　 Seshamma Reddy et.al對(duì)在小鼠的表皮和真皮組織中可能表達(dá)的所有Wnt成員進(jìn)行了檢測(cè)和分析，在小鼠胚胎皮膚

9、和出生后的皮膚中結(jié)果發(fā)現(xiàn)Wnt10b和Wnt5a在毛囊的發(fā)育早期特異表達(dá)，其中，Wnt10b在胚胎時(shí)期皮膚毛囊發(fā)育的啟動(dòng)和出生后毛囊生長(zhǎng)期啟動(dòng)時(shí)表達(dá)水平明顯上調(diào)。不僅如此，以動(dòng)物為模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，外源性Wnt10b蛋白能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠胚胎皮膚毛囊的發(fā)育，在眾多的Wnt家族成員當(dāng)中，只有Wnt10b具有誘導(dǎo)未成熟表皮細(xì)胞向毛干及內(nèi)根鞘細(xì)胞分化，并且能夠刺激體外培養(yǎng)的毛囊毛干生長(zhǎng)的能力。因此，Wnt10b可能通過促使表皮和（或者）

10、真皮細(xì)胞內(nèi)β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中的積累并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，啟動(dòng)相關(guān)靶基因的表達(dá)，繼而調(diào)控毛囊的發(fā)育和生長(zhǎng)，對(duì)其功能的進(jìn)一步探討研究，將有助于開發(fā)解決毛發(fā)疾病的新的治療方法。
　　 綜上所述，Wnt10b在脂肪、骨骼發(fā)育以及腫瘤等的形成中具有重要的作用，在胚胎時(shí)期毛囊發(fā)育過程的基板形成階段，Wnt10b是最早表達(dá)和最顯著的標(biāo)記物之一，說明Wnt10b能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞的分化和毛囊早期的發(fā)育。同時(shí)Wnt10b能夠在體外促進(jìn)皮膚上皮

11、細(xì)胞向毛囊的毛干和內(nèi)根鞘細(xì)胞分化。然而，目前尚無報(bào)道研究Wnt10b在人毛囊組織中的表達(dá)如何，如果有表達(dá)，是通過何種機(jī)制作用于人毛囊細(xì)胞？比如人毛乳頭細(xì)胞，如果Wnt10b能夠作用于人毛乳頭細(xì)胞，那么是通過何種途徑實(shí)現(xiàn)的？對(duì)人毛乳頭細(xì)胞的生物效應(yīng)是增強(qiáng)的，還是抑制的呢？此外，Wnt10b對(duì)人毛囊毛干的分化形成作用如何？因此我們探討和研究了Wnt10b調(diào)控人毛囊生長(zhǎng)的分子機(jī)制。首先我們觀察Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b以及經(jīng)典的Wn

12、t信號(hào)通路下游蛋白β-catenin、LEF-1在生長(zhǎng)期人毛囊組織中的免疫組化表達(dá)情況，檢測(cè)上述幾種Wnts蛋白的表達(dá)水平;接著探討了人毛乳頭細(xì)胞經(jīng)過體外長(zhǎng)期的傳代培養(yǎng)后，與誘導(dǎo)毛囊生成能力相關(guān)的細(xì)胞特異性標(biāo)記物堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(Insulin-likegrowth factor-1，IGF-1）的表達(dá)情況，以及細(xì)胞增殖能力的分析，為進(jìn)一步分析Wnt10b對(duì)人毛乳頭細(xì)胞

13、毛囊誘導(dǎo)能力以及細(xì)胞增殖能力的影響奠定了理論基礎(chǔ);然后證實(shí)在Wnt10b的作用下，體外長(zhǎng)期培養(yǎng)后的人毛囊毛乳頭細(xì)胞的生物效應(yīng)以及人毛乳頭細(xì)胞增殖情況;最后，我們還初步探討了Wnt10b對(duì)生長(zhǎng)期人毛囊毛干生長(zhǎng)的作用以及分子調(diào)控機(jī)制。
　　 第一章、Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b、β-catenin以及LEF-1在人毛囊組織中的表達(dá)
　　 目的：觀察Wnt3a、Wnt5a、Wnt10以及經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路下游蛋白β-

14、catenin、LEF-1在生長(zhǎng)期人毛囊組織中的免疫組化表達(dá)情況。
　　 方法：
　　 取整形外科除皺手術(shù)的額顳部帶完整毛囊組織的健康頭皮皮膚，將頭皮皮膚組織進(jìn)行石蠟包埋、切片后，使用免疫組織化學(xué)染色方法，觀察Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b以及經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路下游蛋白β-catenin、LEF-1在生長(zhǎng)期的人毛囊組織中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 Wnt3a、Wnt5a以及Wnt10b在生長(zhǎng)

15、期的人毛囊組織中均可見有表達(dá)。Wnt3a在人毛囊的外根鞘、內(nèi)根鞘、毛母質(zhì)以及毛干前體細(xì)胞中均可見有表達(dá)，在毛乳頭細(xì)胞中可見微弱的表達(dá);而Wnt5a在毛囊的分布范圍較Wnt3a局限，可見只有在毛母質(zhì)，毛干前體細(xì)胞和內(nèi)根鞘中有表達(dá)，而且表達(dá)較微弱。Wnt10b在生長(zhǎng)期人毛囊表達(dá)部位和Wnt3a相似，但是表達(dá)強(qiáng)度是上述三種Wnts中最強(qiáng)的，除了結(jié)締組織鞘以外，在毛囊的各層結(jié)構(gòu)如內(nèi)根鞘、外根鞘、毛母質(zhì)細(xì)胞以及毛干前體細(xì)胞中均有明顯的表達(dá)，而在毛

16、乳頭亦可見微弱的表達(dá)。β-catenin和LEF-1是經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路兩個(gè)下游蛋白，它們?cè)谏L(zhǎng)期的人毛囊中均有表達(dá)。其中β-catenin在毛母質(zhì)細(xì)胞、毛干前體細(xì)胞和內(nèi)根鞘中有明顯的陽性表達(dá)，在毛乳頭細(xì)胞中有微弱的表達(dá);而LEF-1和β-catenin的表達(dá)部位幾乎一致，只是在毛乳頭細(xì)胞中的表達(dá)較強(qiáng)。
　　 結(jié)論：
　　 Wnt3a、Wnt5a以及Wnt10b在生長(zhǎng)期的人毛囊組織中均可見有表達(dá)，其中以Wnt10b的表

17、達(dá)最強(qiáng)，主要分布在毛囊的內(nèi)根鞘、外根鞘、毛母質(zhì)細(xì)胞以及毛干前體細(xì)胞中，而在毛乳頭細(xì)胞中亦可見微弱的表達(dá)，而經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路了兩個(gè)下游蛋白β-catenin和LEF-1在毛母質(zhì)細(xì)胞、毛干前體細(xì)胞和內(nèi)根鞘，以及毛乳頭細(xì)胞中有明顯的陽性表達(dá)，說明Wnt10b可能是通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路來維持和調(diào)控處于生長(zhǎng)期的人毛囊生長(zhǎng)主要的Wnt家族成員。
　　 第二章、體外培養(yǎng)的人毛乳頭細(xì)胞特異性標(biāo)記物表達(dá)及細(xì)胞增殖能力的

18、分析
　　 目的：探討人毛乳頭細(xì)胞經(jīng)過體外長(zhǎng)期的傳代培養(yǎng)后，與誘導(dǎo)毛囊生成能力相關(guān)的細(xì)胞特異性標(biāo)記物堿性磷酸酶和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的表達(dá)情況，以及細(xì)胞增殖能力的分析。
　　 方法：
　　 使用膠原酶消化+顯微解剖法將人毛乳頭從毛囊中分離后，在體外進(jìn)行人毛乳頭細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，使用real-time QPCR和堿性磷酸酶染色方法檢測(cè)第1代～第8代的人毛乳頭細(xì)胞在不同傳代時(shí)期其特異性標(biāo)記物ALP和IGF-1的表達(dá)結(jié)果

19、，以及通過Cell Counting Kit-8方法檢測(cè)不同的傳代時(shí)期人毛乳頭細(xì)胞增殖能力。
　　 結(jié)果：
　　 人毛乳頭細(xì)胞在體外進(jìn)行長(zhǎng)期的傳代培養(yǎng)過程中，不但逐漸喪失其旋渦狀聚集性的生長(zhǎng)特性，而且ALP和IGF-1隨著傳代代數(shù)的增加，其表達(dá)水平是逐漸降低的。第1代人毛乳頭細(xì)胞ALP和IGF-1表達(dá)水平分別是第8代細(xì)胞表達(dá)水平的6.8和3.5倍。第1代和第2代的人毛乳頭細(xì)胞ALP染色表達(dá)較明顯，但是在第3～6代的人毛乳

20、頭細(xì)胞中，ALP陽性的細(xì)胞逐漸變少，而且染色逐漸變淺;高傳代細(xì)胞如第7、8代細(xì)胞的ALP活性表達(dá)則非常微弱。不同傳代時(shí)期的人毛乳頭細(xì)胞增殖能力，亦隨著傳代代數(shù)的增加而逐漸下降，從傳代培養(yǎng)到第7代開始，細(xì)胞增殖能力出現(xiàn)一個(gè)分水嶺，明顯較第6代以前的細(xì)胞增值能力低。
　　 結(jié)論：
　　 人毛乳頭細(xì)胞經(jīng)過體外長(zhǎng)期的傳代培養(yǎng)后，和誘導(dǎo)毛囊生成能力相關(guān)的特異性標(biāo)記物的表達(dá)水平逐漸下降，從而導(dǎo)致高傳代的人毛乳頭細(xì)胞喪失誘導(dǎo)毛囊生長(zhǎng)的

21、能力。此外，人毛乳頭細(xì)胞亦隨著體外培養(yǎng)傳代代數(shù)的增加，其增殖能力逐漸降低。
　　 第三章、Wnt10b對(duì)體外培養(yǎng)的人毛乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)毛囊生成能力的調(diào)控作用及對(duì)人毛乳頭細(xì)胞增殖的影響
　　 目的：探討Wnt10b對(duì)體外長(zhǎng)期培養(yǎng)后的人毛囊毛乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)毛囊生成能力的調(diào)控作用以及對(duì)人毛乳頭細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 方法：
　　 將人毛乳頭細(xì)胞原代分離，在體外傳代培養(yǎng)到第8代后，加入RecombinantHuma

22、n Wnt-10b共培養(yǎng)，通過免疫熒光染色方法檢測(cè)人毛乳頭細(xì)胞的β-catenin表達(dá)，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，并使用Real-time QPCR檢測(cè)與毛乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)能力相關(guān)的特異性標(biāo)記物ALP和IGF-1的表達(dá)，堿性磷酸酶染色檢測(cè)Wnt10b對(duì)人毛乳頭細(xì)胞的作用，以及通過Cell Counting Kit-8方法檢測(cè)Wnt10b對(duì)人毛乳頭細(xì)胞增殖的影響作用。
　　 結(jié)果：
　　 Wnt10b能夠通過經(jīng)典的Wnt/β-cat

23、enin信號(hào)通路作用于在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)后的人毛乳頭細(xì)胞，上調(diào)人毛乳頭細(xì)胞特異性標(biāo)記物ALP和IGF-1的表達(dá)，并恢復(fù)高傳代人毛乳頭細(xì)胞聚集性漩渦狀生長(zhǎng)特性，從而維持人毛乳頭細(xì)胞的誘導(dǎo)能力。此外，Wnt10b對(duì)體外經(jīng)過長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)后的人毛乳頭細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。
　　 結(jié)論：
　　 Wnt10b能夠通過上調(diào)特異性標(biāo)記物ALP和IGF-1的表達(dá)以及恢復(fù)高傳代人毛乳頭細(xì)胞聚集性漩渦狀生長(zhǎng)特性來維持體外長(zhǎng)期培養(yǎng)后的人毛乳頭細(xì)胞的

24、毛囊誘導(dǎo)能力，以及具有促進(jìn)長(zhǎng)期培養(yǎng)后的人毛乳頭細(xì)胞增殖能力的作用。
　　 第四章、初步探討Wnt10b對(duì)人毛囊毛干生長(zhǎng)的影響作用
　　 目的：Wnt10b對(duì)生長(zhǎng)期人毛囊毛干生長(zhǎng)的影響作用及調(diào)控機(jī)制的初步探討。
　　 方法：
　　 將人毛囊組織進(jìn)行顯微解剖分離后，分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。①空白對(duì)照組:人毛囊+DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)。②實(shí)驗(yàn)組:將Recombinant HumanWnt-10b2μg/ml加入

25、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，和人毛囊共培養(yǎng)。上述實(shí)驗(yàn)分組每組設(shè)6個(gè)毛囊樣本，3天換液一次，培養(yǎng)5天后，在雙目體視解剖顯微鏡下測(cè)量各實(shí)驗(yàn)組毛干生長(zhǎng)長(zhǎng)度。
　　 結(jié)果：
　　 將完整的生長(zhǎng)期人毛囊進(jìn)行器官培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組相比于空白對(duì)照組，和Recombinant Human Wnt-10b共培養(yǎng)的人毛囊毛干生長(zhǎng)速度明顯增加，毛干長(zhǎng)度比對(duì)照組長(zhǎng)。
　　 結(jié)論：
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在空白對(duì)照組中，將人毛囊器官和無血清的培

26、養(yǎng)基培養(yǎng)后，毛干生長(zhǎng)速度緩慢;而在實(shí)驗(yàn)組中，由于加入了Recombinant Human Wnt-10b，毛干生長(zhǎng)速度明顯較空白對(duì)照組快，毛干生長(zhǎng)長(zhǎng)度更長(zhǎng)，證實(shí)Wnt10b對(duì)人毛干的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。
　　 全文小結(jié)：
　　 1.在生長(zhǎng)期的人毛囊組織上檢測(cè)Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b以及經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路下游蛋白β-catenin和LEF-1的表達(dá)情況，其中Wnt10b的陽性表達(dá)最明顯，而β-cateni

27、n和LEF-1與Wnt10b在毛母質(zhì)、毛干前體細(xì)胞和內(nèi)根鞘，以及毛乳頭出現(xiàn)表達(dá)重疊的現(xiàn)象，說明Wnt10b可能是通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路來維持和調(diào)控處于生長(zhǎng)期的人毛囊生長(zhǎng)主要的Wnt家族成員。
　　 2.檢測(cè)了人毛乳頭細(xì)胞經(jīng)過體外長(zhǎng)期的傳代培養(yǎng)后，與誘導(dǎo)毛囊生成能力相關(guān)的細(xì)胞特異性標(biāo)記物ALP和IGF-1的表達(dá)情況，以及細(xì)胞增殖能力的分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明經(jīng)過體外長(zhǎng)期的傳代培養(yǎng)后，人毛乳頭細(xì)胞的ALP和IGF-1

28、表達(dá)水平和細(xì)胞的增殖能力并不是恒定不變的，而表現(xiàn)為一種逐漸下降的趨勢(shì)，為進(jìn)一步驗(yàn)證Wnt10b對(duì)人毛囊生長(zhǎng)的調(diào)控作用提供了理論基礎(chǔ);
　　 3.觀察了Wnt10b對(duì)體外長(zhǎng)期培養(yǎng)后的人毛囊毛乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)毛囊能力的調(diào)控機(jī)制，以及細(xì)胞增殖能力的影響作用，證實(shí)了Wnt10b具有能夠維持人毛乳頭細(xì)胞的誘導(dǎo)能力以及促進(jìn)其增殖的作用;
　　 4.初步探討Wnt10b對(duì)人毛囊毛干的作用，證實(shí)了Wnt10b能夠促進(jìn)人毛囊毛干的生長(zhǎng);