Wnt10b與毛囊發(fā)育啟動(dòng)中基板形成及其分布的關(guān)系.pdf

1、研究背景：
　　 毛囊是人體最為復(fù)雜的微小器官之一，其最主要的功能就是生長(zhǎng)毛發(fā)。毛發(fā)對(duì)身體主要有人體防護(hù)、保溫、掩飾、分泌汗液和皮脂、感覺和傳導(dǎo)信息的作用，其中，最主要的作用是增加信息交流及傳遞美感。禿發(fā)及多毛癥目前是個(gè)世界性的難題，根據(jù)一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)，全世界大約50％的成年人均要面對(duì)雄激素源性脫發(fā)這個(gè)棘手問題。盡管毛發(fā)疾病一般不威脅人體生命，但是其對(duì)人們的心理沖擊卻是難以估量的。由于對(duì)毛囊發(fā)生、發(fā)育和生長(zhǎng)周期的調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚，

2、迄今為止，醫(yī)學(xué)界對(duì)上述疾患仍無十分臺(tái)效的治療方法。因此，了解毛發(fā)的發(fā)育及再生機(jī)制、實(shí)現(xiàn)毛發(fā)的高效再生是近年來的一件迫在眉睫的難題。
　　 在胚胎發(fā)育期間，毛囊的形態(tài)發(fā)生依賴于真皮和表皮間一系列信號(hào)的調(diào)控，它們介導(dǎo)了兩個(gè)細(xì)胞群體之間的相互作用，誘導(dǎo)兩個(gè)細(xì)胞群體有序增殖和分化，引導(dǎo)細(xì)胞最終形成毛干、根鞘和毛乳頭。這些信號(hào)包括Wnt/Wingless家族、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族(FGFs)、骨形成蛋白家族(BMPs)、外胚葉發(fā)育不全基

3、因(Eda/Edar)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGF-β2)、Sonic Hedgehog(Shh)等。其中，許多基因敲除和轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物模型提示W(wǎng)nt信號(hào)是促進(jìn)毛囊發(fā)育的關(guān)鍵因子。
　　 Wnt家族蛋白與果蠅Wingless蛋白同源，是一類脂質(zhì)修飾的分泌型糖蛋白家族。Wnt信號(hào)通路可分為3個(gè)分支：Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路、Wnt/平面細(xì)胞通路、Wnt/Ca2＋通路。其中，Wnt/β-catenini通路通過調(diào)控

4、細(xì)胞漿中β-catenin的水平濃度而發(fā)揮作用，當(dāng)Wnt信號(hào)不存在時(shí)，細(xì)胞漿中的β-catenin很快就被降解；當(dāng)Wnt信號(hào)存在時(shí)，Wnt信號(hào)抑制β-catenin被降解，在細(xì)胞漿中積聚并部分轉(zhuǎn)移到胞核，啟動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)。Wnt信號(hào)決定了未分化表皮細(xì)胞的命運(yùn)。在轉(zhuǎn)基因小鼠中，當(dāng)表皮細(xì)胞被強(qiáng)行表達(dá)Wnt信號(hào)的抑制劑Dkkl或者表皮細(xì)胞缺少β-catenin時(shí)，所有的毛囊缺失；相反，當(dāng)表皮細(xì)胞被強(qiáng)行表達(dá)β-catenin時(shí)，毛囊發(fā)育異常增

5、多。然而，人和小鼠的Wnt家族成員有19種之多，究竟是哪一種或者幾種Wnt蛋白在毛囊形成中有效發(fā)揮以及如何發(fā)揮其作用仍未明了。
　　 對(duì)在小鼠身上有表達(dá)的所有Wnt成員進(jìn)行全面檢測(cè)分析，包括小鼠胚胎皮膚和出生后的皮膚在內(nèi)，只有Wnt10b、Wnt10a、Wnt5a在毛囊的發(fā)育早期特異表達(dá)，其中，Wnt10b在胚胎皮膚毛囊發(fā)育啟動(dòng)和成年毛囊再生啟動(dòng)時(shí)表達(dá)尤其明顯。不僅如此，一些實(shí)驗(yàn)提示外源性Wnt10b蛋白能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠胚

6、胎皮膚毛囊的發(fā)育，在Wnt3、Wnt5a、Wnt11和Wnt10b這幾個(gè)Wnt成員當(dāng)中，只有Wnt10b具有誘導(dǎo)未成熟表皮細(xì)胞向毛干及內(nèi)根鞘細(xì)胞分化，和刺激體外培養(yǎng)的毛囊毛干生長(zhǎng)的能力。據(jù)此，我們推測(cè)：Wnt10b極有可能促使β-catenin在表皮和(或)真皮細(xì)胞胞漿積聚并核轉(zhuǎn)移，啟動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)，繼而誘導(dǎo)毛囊的發(fā)育，對(duì)其功能的進(jìn)一步研究，將有助于開發(fā)針對(duì)毛發(fā)疾病的新療法。
　　 為了進(jìn)一步闡明Wnt10b在毛囊發(fā)育過程中的

7、具體作用，我們首先觀察Wnt10b/β-catenin在大鼠胚胎皮膚毛囊形態(tài)發(fā)生過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)；同時(shí)，體外構(gòu)建適合研究毛囊發(fā)育啟動(dòng)的胎鼠皮膚培養(yǎng)模型，該模型不僅毛囊短期發(fā)育與體內(nèi)一致，而且培養(yǎng)條件穩(wěn)定、便于實(shí)驗(yàn)干預(yù)；然后利用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組Writ10b蛋白，接著將重組Wnt10b蛋白和RNA干擾技術(shù)與培養(yǎng)模型結(jié)合，分別模擬基因調(diào)控技術(shù)中的功能獲得性突變和功能缺失性突變，探討胎鼠皮膚Wnt10b蛋白的表達(dá)強(qiáng)弱與毛囊發(fā)育啟動(dòng)中基板形

8、成及其分布的關(guān)系。
　　 第一章 大鼠胚胎皮膚毛囊形態(tài)發(fā)生與Wnt10b/β-catenin的表達(dá)
　　 目的：
　　 觀察SD大鼠胚胎背部皮膚毛囊的形態(tài)發(fā)生和Wnt10b/β-catenin信號(hào)在毛囊發(fā)育過程中的表達(dá)。
　　 方法
　　 取胎齡13～20d的SD大鼠胚胎及1.3d新生鼠的背部皮膚，采用石蠟包埋、切片、HE染色，對(duì)SD大鼠胚胎皮膚毛囊的發(fā)生過程及其形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行描述，同時(shí)應(yīng)用熒光免

9、疫組化染色，觀察Wn10b及β-catenin在毛囊發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)。
　　 結(jié)論
　　 SD大鼠背部皮膚最早期的毛囊發(fā)育啟動(dòng)于胎齡15.5～16d，基木結(jié)束于出生后第3d;Wnt10b及β-catenin參與啟動(dòng)毛囊的形態(tài)發(fā)生和毛囊的進(jìn)一步發(fā)育。
　　 第二章 大鼠毛囊發(fā)育啟動(dòng)階段模型構(gòu)建及其Wnt10b/β-catenin信號(hào)表達(dá)的觀察
　　 目的：
　　 構(gòu)建適合研究毛囊發(fā)育啟動(dòng)的胎鼠皮

10、膚體外器官培養(yǎng)模型，觀察Wnt10b/β-catenin信號(hào)在該模型毛囊發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)。
　　 方法
　　 將胎齡14d～17d的胎鼠背部皮膚以明膠海綿為載體，在DMEM培養(yǎng)液的氣液交界平面中漂浮培養(yǎng)3-6d，石蠟包埋、切片、HE染色，觀察毛囊發(fā)育并與體內(nèi)毛囊發(fā)育橫向比較；免疫熒光法動(dòng)態(tài)觀察Wnt10b及β-catenin在該模型毛囊發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)；將胎齡15d的胎鼠背部皮膚在含不同胎牛血清濃度的DMEM中培

11、養(yǎng)，3d后取出皮膚組織、石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下觀察各組毛囊數(shù)量并做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 結(jié)論
　　 在體外短期培養(yǎng)的胎鼠背部皮膚毛囊發(fā)育及Wnt10b/β-catenin信號(hào)的表達(dá)與體內(nèi)基本一致，可以作為研究毛囊發(fā)育啟動(dòng)的模型；Wnt10b/β-catenin信號(hào)的表達(dá)與毛囊的發(fā)育密切相關(guān)。
　　 第三章 Wnt10b蛋白促進(jìn)大鼠胚胎皮膚毛囊發(fā)育及其機(jī)制的初步探討
　　 第一節(jié) 人Wnt10b基因真

12、核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)
　　 目的：
　　 利用基因工程技術(shù)獲得人Wnt10b基因真核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞并檢測(cè)其在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 方法
　　 以pUC19-Wnt10b模板，設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增出1170 bp的人Wnt10b基因的cDNA編碼區(qū)序列，然后將PCR產(chǎn)物純化、純化后的PCR產(chǎn)物和pEGFP-N1載體分別用EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ進(jìn)行酶切

13、，再次純化以上兩種酶切產(chǎn)物并回收，用T4DNA連接酶將兩種純化后的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)過菌落PCR，酶切鑒定后送去英駿公司測(cè)序鑒定；用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將鑒定正確的載體轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞中，用Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)COS-7細(xì)胞Wnt10b蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)論
　　 本研究成功構(gòu)建了包含人Wnt10b基因的pEGFP-N1-Wnt10

14、b真核表達(dá)載體;將pEGFP-N1-Wnt10b轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，COS-7細(xì)胞能夠表達(dá)重組Wnt10b蛋白，這為研究Wnt10b在毛囊發(fā)育過程中的作用及其機(jī)制提供一個(gè)有利的研究工具。
　　 第二節(jié) 重組人Wnt10b蛋白促進(jìn)大鼠胚胎皮膚毛囊發(fā)育的初步探討
　　 目的：
　　 觀察基因工程重組的人Wnt10b蛋白能否促進(jìn)大鼠胚胎皮膚毛囊的發(fā)育和探討其潛在機(jī)制。
　　 方法
　　 將pEGFP-N

15、1-Wnt10b體外轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后繼續(xù)用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每天收集培養(yǎng)上清液，制備含有Wnt10b蛋白的DMEM培養(yǎng)液；將胎齡14.5～15d的胎鼠背部皮膚置于含有Wnt10b蛋白的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)3d，在培養(yǎng)的第48h取出部分組織用Western blot檢測(cè)Wnt10b蛋白和β-catenin的含量；在培養(yǎng)的第72h，將皮膚組織取出石蠟包埋、切片，HE染色，鏡下觀察各組毛囊發(fā)育情況并做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　

16、 結(jié)論
　　 當(dāng)胎鼠背部皮膚在體外培養(yǎng)時(shí)，Wnt10b蛋白促進(jìn)皮膚的毛囊發(fā)育，而且，Wnt10b蛋白很可能通過經(jīng)典的Writ信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞β-catenin水平來發(fā)揮作用的。
　　 第四章 靶向Wnt10b的siRNA抑制胚胎皮膚毛囊發(fā)育的初步研究
　　 目的：
　　 利用RNA干擾技術(shù)抑制體外培養(yǎng)的胎鼠皮膚Wnt10b蛋白的表達(dá)，觀察沉默Wnt10b基因的表達(dá)能否抑制毛囊的發(fā)育和探討其潛在機(jī)制。

17、>　　 方法
　　 采用廣州銳博生物科技有限公司提供的3條siRNA-Wnt10b正反義鏈和1條陰性對(duì)照的正反義鏈；按分組將胎齡14.5～15d的胎鼠背部皮膚置于含有siRNA/LipofectamineTm2000復(fù)合物的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，24h后更換為含1O％FBS的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。分別在培養(yǎng)的第24h、48h和72h取出部分組織用熒光定量PCR檢測(cè)皮膚組織Wnt10b和β-catenin的mRNA表達(dá)

18、；在培養(yǎng)的第72h，取出部分組織用Western blot檢測(cè)皮膚組織Wnt10b和β-catenin的蛋白含量。將上述方法篩選出的最佳序列和對(duì)照組再次重復(fù)上述步驟培養(yǎng)，72h后取出皮膚組織石蠟包埋、切片，HE染色，鏡下觀察各組毛囊發(fā)育情況并做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 結(jié)論
　　 在體外器官培養(yǎng)的環(huán)境中，siRNA能夠抑制胎鼠背部皮膚組織Wnt10b蛋白的表達(dá)，從而抑制毛囊發(fā)育的啟動(dòng)，減少新形成毛囊的數(shù)量；siRNA與胎鼠皮膚