新基因Gsdma3對小鼠毛囊周期及Wnt-β-catenin信號(hào)通路作用的研究.pdf

1、背景:
　　毛囊是皮膚的重要附屬器官，由多種類型細(xì)胞組成。出生后，小鼠毛囊經(jīng)歷周期性的生長(anagen)、退化(catagen)及靜止(telogen)三個(gè)階段的不斷重復(fù)。在經(jīng)歷一段時(shí)期的生長后，小鼠毛囊進(jìn)入退化期，此時(shí)毛球部細(xì)胞開始凋亡，逐漸形成上皮細(xì)胞索，DP被逐漸拉向表皮。當(dāng)上皮細(xì)胞索徹底消失后，DP位于靠近Bulge的位置，毛囊退化停止，進(jìn)入靜止期。在經(jīng)歷一段時(shí)間的休息之后，毛囊感受到外界信號(hào)刺激，位于次級(jí)毛芽處的細(xì)胞最

2、先開始增殖，觸發(fā)新一輪的毛囊發(fā)育，之后bulge處的毛囊干細(xì)胞開始增殖，并向下遷移形成快速增殖細(xì)胞，毛囊開始下一輪周期循環(huán)。
　　毛囊周期異常往往導(dǎo)致嚴(yán)重的毛囊疾病，如斑禿，雄激素性脫發(fā)，老年性脫發(fā)及產(chǎn)后脫發(fā)等，給患者身心帶來巨大傷害，并且目前的治療方式尚不理想，因此對毛囊周期調(diào)控的研究有助于為臨床治療脫發(fā)提供參考。
　　多種信號(hào)通路參與毛囊周期循環(huán)的調(diào)控，其中最重要的是Wnt/β-catenin信號(hào)通路。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了19

3、個(gè)Wnt家族成員，根據(jù)胞內(nèi)傳播路徑的不同分為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路（即Wnt/β-catenin信號(hào)通路）及非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路。其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路作用于毛囊細(xì)胞的增殖及分化，參與毛囊形態(tài)發(fā)生及毛囊周期循環(huán)，因此一直受到毛囊研究者的關(guān)注。目前有關(guān)毛囊周期調(diào)控的報(bào)道多集中于生長期向退化期轉(zhuǎn)變及靜止期向生長期轉(zhuǎn)變兩方面，而退化期向靜止期轉(zhuǎn)變這方面的研究很少。
　　GasderminA3(Gsdma3)基因隸屬于Gasd

4、ermin基因家族，特異性的表達(dá)于小鼠表皮及毛囊角質(zhì)形成細(xì)胞。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Gsdma3基因突變后小鼠毛囊周期出現(xiàn)異常，同時(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵分子β-catenin的表達(dá)量升高，提示Gsdma3基因?qū)γ抑芷谟姓{(diào)控作用，其機(jī)制可能與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用相關(guān)。
　　目的:
　　本課題擬通過分析Gsdma3基因在突變及過表達(dá)的情況下，對小鼠毛囊周期進(jìn)程的作用及對Wnt/β-caten

5、in信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)的影響，證實(shí)Gsdma3基因是調(diào)節(jié)小鼠毛囊周期新因子，同時(shí)具有抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用，以此加深對Gsdma3基因功能的認(rèn)識(shí)，豐富毛囊周期信號(hào)調(diào)控相關(guān)的理論，同時(shí)還可為臨床相關(guān)疾病治療的研究提供參考。
　　方法:
　　1.Gsdma3基因突變對毛囊周期影響的研究
　　通過H&E染色觀察Gsdma3基因突變鼠毛囊周期變化，并經(jīng)過免疫熒光及堿性磷酸酶染色觀察毛乳頭(DP)位置變化

6、;
　　2.Gsdma3基因回補(bǔ)對Gsdma3基因突變鼠毛囊周期影響的研究
　　3.Gsdma3基因突變對毛囊第二輪生長期影響的研究
　　通過外部觀察及H&E染色檢查Gsdma3基因突變鼠第二輪毛囊生長期與野生型鼠是否一致;利用免疫熒光觀察細(xì)胞增殖及毛囊干細(xì)胞變化，并通過免疫熒光及TUNEL實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞增殖及凋亡。
　　4.Gsdma3基因突變對Wnt/β-catenin信號(hào)通路分子表達(dá)影響的研究
　　(1

7、)通過PCR array及免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察Gsdma3基因突變鼠各時(shí)期Wnt/β-catenin信號(hào)通路分子表達(dá)變化;
　　(2)采用免疫熒光技術(shù)，觀察Gsdma3及β-catenin的表達(dá)及定位;觀察Wnt10b、β-catenin及l(fā)eft在毛囊周期各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá);
　　(3)統(tǒng)計(jì)Gsdma3基因突變鼠不同周期毛囊核陽性β-catenin細(xì)胞數(shù)。
　　(4)退化期Gsdma3基因突變鼠回補(bǔ)Gsdma3及含有突變位點(diǎn)

8、的Gsdma3表達(dá)，觀察毛Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)變化;
　　(5)退化期野生型鼠過表達(dá)wnt10b，觀察毛囊周期變化。
　　5.Gsdma3基因抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的研究
　　(1)通過在野生型鼠中過表達(dá)Gsdma3基因，用H&E、免疫熒光方法觀察Gsdma3基因?qū)?nèi)源性Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響;
　　(2)在野生型鼠皮膚注射wnt0b腺病毒升高外源性Wn

9、t/β-catenin信號(hào)通路，同時(shí)注射Gsdma3腺病毒，經(jīng)H&E、免疫熒光檢測Gsdma3基因?qū)ν庠葱訵nt/β-catenin信號(hào)通路及細(xì)胞增殖的影響;
　　(3)培養(yǎng)JB6細(xì)胞，通過腺病毒過表達(dá)Gsdma3及wnt10b，利用TOP/FOP雙熒光素酶報(bào)告基因及免疫熒光檢測Gsdma3基因?qū)﹄x體培養(yǎng)表皮細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路及細(xì)胞增殖的影響。
　　6.Gsdma3基因調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通

10、路分子機(jī)制的研究
　　(1)運(yùn)用啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒，對Wnt/β-catenin信號(hào)通路核心分子wnt0b的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)行分析;
　　(2)利用抗Gsdma3抗體進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證Gsdma3是否為轉(zhuǎn)錄因子，以及尋找Gsdma3調(diào)控靶基因;
　　(3)經(jīng)RT-PCR檢測Gsdma3基因突變鼠不同毛囊周期階段維甲酸信號(hào)分子表達(dá)，通過維甲激動(dòng)劑與Gsdma3過表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合使用，觀察Gsdma3基因與維甲酸信號(hào)以及維甲酸信號(hào)與

11、wnt0b基因表達(dá)的關(guān)系。
　　結(jié)果與討論:
　　1.Gsdma3基因突變引起毛囊靜止期缺失
　　(1) Gsdma3基因突變鼠毛囊周期缺少靜止期，在毛囊周期循環(huán)中Gsdma3基因突變鼠一直保留上皮細(xì)胞索結(jié)構(gòu)，使DP始終遠(yuǎn)離Bulge;
　　2.Gsdma3基因回補(bǔ)后Gsdma3基因突變鼠毛囊進(jìn)入靜止期。
　　3.Gsdma3基因突變不影響毛囊第二輪生長期進(jìn)入
　　Gsdma3基因突變鼠進(jìn)入第二輪毛囊

12、生長期時(shí)間與野生型鼠相同;退化期毛囊增殖增加，凋亡減少;在退化期末，Gsdma3基因突變鼠退化上皮細(xì)胞索細(xì)胞增殖強(qiáng)烈;Gsdma3基因突變鼠不存在次級(jí)毛芽結(jié)構(gòu)，但退化上皮細(xì)胞索下方細(xì)胞在第二輪生長期轉(zhuǎn)換為次級(jí)毛芽結(jié)構(gòu)，彌補(bǔ)了這一不足。
　　4.Wnt/β-catenin信號(hào)通路分子在Gsdma3基因突變鼠背部皮膚中表達(dá)上調(diào)
　　(1) Gsdma3基因突變鼠各時(shí)期Wnt/β-catenin信號(hào)通路分子表達(dá)升高;
　　(

13、2)退化期毛囊存在Gsdma3及β-catenin的表達(dá)及定位;Wnt10b、β-catenin及l(fā)ef1在Gsdma3基因突變鼠表達(dá)升高;
　　(3)Gsdma3基因突變鼠不同周期毛囊核陽性β-catenin細(xì)胞數(shù)增多;
　　(4)回補(bǔ)Gsdma3基因（而不是含有突變位點(diǎn)的Gsdma3基因）導(dǎo)致退化期Gsdma3基因突變鼠Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性下降;
　　(5)野生型鼠過表達(dá)wnt0b，引起退化期延長

14、。
　　5.Gsdma3基因?qū)nt/β-catenin信號(hào)通路有抑制作用
　　(1)通過野生型鼠過表達(dá)Gsdma3基因，引起內(nèi)源性Wnt/β-catenin信號(hào)通路分子表達(dá)降低，同時(shí)抑制了細(xì)胞增殖;
　　(2)在野生型鼠過表達(dá)Gsdma3基因，導(dǎo)致外源性Wnt/β-catenin信號(hào)通路分子表達(dá)降低及細(xì)胞增殖減少。
　　(3)過表達(dá)Gsdma3基因抑制離體培養(yǎng)JB6細(xì)胞的TOP/FOP報(bào)告基因活性，并且抑制經(jīng)w

15、nt10b腺病毒升高的wnt10b、β-catenin及l(fā)ef1的表達(dá)及細(xì)胞增殖。
　　6.Gsdma3基因可能通過升高維甲酸信號(hào)抑制wnt10b基因表達(dá)
　　(1)Gsdma3基因不能直接抑制wnt10b的啟動(dòng)子活性;
　　(2)ChIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Gsdma3不是轉(zhuǎn)錄因子，因此Gsdma3基因可能通過間接途徑調(diào)控wnt10b分子表達(dá);
　　(3)Gsdma3基因突變鼠背部皮膚維甲酸信號(hào)分子表達(dá)下降，Gsdma3基

16、因可以通過激活維甲酸信號(hào)抑制wnt10b基因表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)Gsdma3基因突變會(huì)引起毛囊退化期向靜止期的轉(zhuǎn)變受阻、毛囊退化期延長，但不影響下一生長期到來，因此導(dǎo)致靜止期缺失。而Wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)控這一過程中起重要作用。Gsdma3基因具有抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的能力，并且可能通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響毛囊周期轉(zhuǎn)換。Gsdma3基因?qū)nt/β-c