鏈脲佐菌素致大鼠胰島的損傷與修復.pdf

1、目的
　　1、比較不同劑量鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)對大鼠胰腺的影響,選擇適于胰島β細胞損傷及修復研究的模型。
　　2、探討 STZ對β細胞的損傷情況,以及損傷后的高糖條件下胰島素陽性細胞(Insulin-Positive Cells, IPCs)是否存在著修復與代償。
　　3、探討乳鼠胰腺體外培養(yǎng)的組織細胞中,是否存在具有干/祖細胞特性的細胞。
　　方法
　　第一部分:實驗分為S

2、TZ40mg/kg組,50mg/kg組,60mg/kg組,25mg/kg連續(xù)3次、每次25mg/kg間隔1天(25mg/kg×3)組和空白對照組。給藥后0、1、3、7、11、24、48、72h檢測血糖,之后每3天測量1次,期間觀察動物一般情況,并于第9周進行血清生化指標和胰腺、腎、肝及眼睛的病理學檢查。
　　第二部分:通過25mg/kg×3方案腹腔注射 STZ,誘導大鼠糖尿病模型,此后每3天檢測1次血糖,于實驗的第63d腹主動脈取

3、血測量空腹血糖、胰島素、C-肽,取胰腺制作組織切片,進行蘇木素-伊紅(Hematein-Eosin Staining, HE)染色和胰島素免疫組織化學(Immunohistochemistry, IHC)染色,以及胰島素和ki67核抗原(ki67 Nuclear Antigen, ki67)免疫熒光(Immunohistochemistry, IF)雙染色。比較β細胞損傷后胰島素的分泌情況,對血糖的影響情況,IPCs的損傷情況以及IPC

4、s和ki67雙染的情況。
　　第三部分:取出生4天的乳鼠的胰腺剪成1mm×1mm小塊,分別于10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、1%鏈、青酶素配置的LDMEM和HDMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),待細胞長至10-20層之內(nèi)進行傳代,傳代后待細胞長至皿面積的80%時進行第二次傳代,觀察組織培養(yǎng)的細胞形態(tài),期間對 P1代細胞進行干/祖性質(zhì)鑒定,進行早期干/祖特性的標記Oct4、Sox2 IF染色,之后進行胰腺內(nèi)分泌相

5、關基因的mRNA水平檢測,包括 Ngn3、Pdx1、InsulinI、InsulinII,確定是否具有向胰腺內(nèi)分泌方向分化的干/祖細胞。
　　結(jié)果
　　第一部分 STZ40mg/kg,50mg/kg,60mg/kg和25mg/kg×3均可引發(fā)大鼠糖尿病,其中,25mg/kg×3方法動物死亡率低、模型性狀穩(wěn)定。72h內(nèi)血糖檢測:STZ造模時動物血糖先輕微升高后降低之后再大幅度升高。50mg/kg和60mg/kg組出現(xiàn)給藥后第3

6、天死亡現(xiàn)象,40mg/kg,50mg/kg,60mg/kg和25mg/kg×3組存活鼠成模率分別為70%、80%、100%、100%。40mg/kg組于第10周出現(xiàn)白內(nèi)障,其他實驗組均于第8周出現(xiàn)白內(nèi)障。第9周血清生化檢測發(fā)現(xiàn)40mg/kg組胰島素、C-肽、urea、UA、Cr、ALT、AST、TP、ALB與空白對照組無差異,其它實驗組上述指標均有異常改變。胰腺、腎、肝的病理學結(jié)果支持上述改變。
　　第二部分25mg/kg×3劑量

7、STZ致使β細胞明顯損傷,胰島素、C-肽降低,空腹血糖升高。存在殘存的胰島中IPCs復制率增加和胰腺外分泌導管中IPCs異位表達兩種代償方式。
　　第三部分 LDMEM更適合于胰腺細胞的培養(yǎng),通過對 P1代細胞鑒定發(fā)現(xiàn):乳鼠的胰腺中存在著 Sox2陽性的干/祖細胞,并且具有向胰腺方向分化的 Ngn3的mRNA的表達。
　　結(jié)論
　　利用STZ誘導大鼠糖尿病模型的探討,我們發(fā)現(xiàn)高糖血癥對全身的器官具有廣泛的影響,為了減少