AT1受體調(diào)控鏈脲佐菌素致胰島β細(xì)胞凋亡及在厄貝沙坦保護(hù)機(jī)制中的作用研究.pdf

1、目的:以建立胰島素瘤NIT-1細(xì)胞血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)基因沉默模型為基礎(chǔ)，研究AT1受體調(diào)控鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡的變化效應(yīng)，并以此角度探討厄貝沙坦拮抗STZ誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的保護(hù)機(jī)制。
　　方法:(1) AT1R基因沉默細(xì)胞模型:采用siRNA干擾技術(shù)沉默AT1R:針對小鼠AT1R，設(shè)計(jì)并合成3對siRNA干擾序列，以脂質(zhì)體為載體轉(zhuǎn)染至NIT-1細(xì)胞。用不同濃度的標(biāo)記熒光分子的siRNA序列轉(zhuǎn)染細(xì)

2、胞，熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度檢測轉(zhuǎn)染效率;Ral-time PCR檢測AT1R mRNA表達(dá)量判斷不同干擾序列及干擾時(shí)間的基因沉默效果。(2)實(shí)驗(yàn)分組:①空白組，②STZ組，③厄貝沙坦+STZ組，④si-AT1R組，⑤si-AT1R+ STZ組，⑥si-AT1R+厄貝沙坦+STZ組，以5mM STZ干預(yù)30min特異性損傷NIT-1細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;厄貝沙坦干預(yù)時(shí)先用0.01mM厄貝沙坦孵育細(xì)胞2h，再用5 mM STZ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，然后

3、換含0.01 mM厄貝沙坦的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3-6次。(3)檢測指標(biāo):①細(xì)胞凋亡觀察:采用Hoechst33342染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，②細(xì)胞凋亡率檢測:AnnexinⅤ-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測，③Caspase-3、NADPH表達(dá):Real-time PCR檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的Caspase-3、NADPH mRNA表達(dá)量。
　　結(jié)果:(1)40nM siRNA轉(zhuǎn)染的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，轉(zhuǎn)染后AT1

4、R mRNA表達(dá)量明顯減少，干擾序列si-AT1R-2轉(zhuǎn)染24h的沉默效果最佳(92.20％)。(2)①細(xì)胞凋亡率:與空白組比較，STZ組凋亡明顯升高（P＜0.05）;與STZ組相比，厄貝沙坦+STZ組凋亡明顯降低(P＜0.05);與空白組比較，si-AT1R組凋亡無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與STZ組相比，si-AT1R-2+STZ組凋亡減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與si-AT1R-2組相比，si-AT1

5、R-2+STZ組凋亡升高(P＜0.05);與si-AT1R-2+STZ組相比，si-AT1R-2+厄貝沙坦+STZ組凋亡減少(P＜0.05);沉默AT1R后，厄貝沙坦減少細(xì)胞凋亡率的幅度降低了，即其抗凋亡的能力下降了，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。②Caspase-3、NADPH mRNA表達(dá)量:與空白組比較，STZ組兩指標(biāo)均明顯升高(P＜0.05);與STZ組相比，厄貝沙坦+STZ組兩指標(biāo)均明顯降低(P＜0.05);與空白組比較，

6、si-AT1R組兩指標(biāo)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與STZ組相比，si-AT1R-2+STZ組Caspase-3 mRNA表達(dá)量有減少趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，NADPH mRNA表達(dá)量無明顯變化;與si-AT1R-2組相比，si-AT1R-2+STZ組兩指標(biāo)均升高(P＜0.05);與si-AT1R-2+STZ組相比，si-AT1R-2+厄貝沙坦+STZ組兩指標(biāo)均減少(P＜0.05):沉默AT1R后，C