經(jīng)鼻吸入胰島素對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的阿爾茨海默病大鼠模型的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是導(dǎo)致癡呆最常見的病因，然而目前尚無有效的治療方法可以阻止或者延緩疾病的進(jìn)展。在探索散發(fā)性AD的發(fā)病機(jī)理的過程中，越來越多的證據(jù)表明胰島素信號(hào)通路異常在AD發(fā)病中起著非常重要的作用。因此，以胰島素信號(hào)通路為靶向治療AD得到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。經(jīng)鼻吸入胰島素已經(jīng)被證實(shí)可以改善健康受試者和AD患者的記憶和注意力，但這種保護(hù)作用的具體機(jī)制仍待闡明。我們前期的研究

2、發(fā)現(xiàn)，給予AD轉(zhuǎn)基因小鼠（3×Tg-AD小鼠）經(jīng)鼻吸入胰島素1周后，可以改善胰島素信號(hào)通路異常，降低腦內(nèi)Aβ40(amyloid beta，Aβ)的含量。但經(jīng)鼻吸入胰島素是否能夠增加腦葡萄糖代謝，減輕神經(jīng)炎癥，改善突觸功能，降低tau蛋白的磷酸化水平，進(jìn)而改善認(rèn)知功能障礙，有待我們進(jìn)一步探索和研究。側(cè)腦室注射鏈脲佐菌素（intracerebroventricular streptozotocin-inj ected，ICV-STZ）的大

3、鼠模型，是一種被廣泛應(yīng)用的散發(fā)性AD(sporadic AD，SAD)的模型，表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙和許多類似AD樣的病理改變?nèi)缫葝u素抵抗，腦代謝降低，神經(jīng)炎癥和tau蛋白過度磷酸化等。為了進(jìn)一步研究經(jīng)鼻吸入胰島素對(duì)散發(fā)性AD的治療作用，尤其是對(duì)認(rèn)知功能、腦代謝及tau磷酸化的影響，我們采用ICV-STZ大鼠模型，連續(xù)經(jīng)鼻吸入胰島素6周（2U/天）后，檢測(cè)各組大鼠的一般情況，行為學(xué)，腦葡萄糖代謝和分子生物學(xué)指標(biāo)的改變，為進(jìn)一步開展后期臨床試

4、驗(yàn)提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。
　　研究?jī)?nèi)容和結(jié)果:
　　1.本研究中，我們將所有的大鼠隨機(jī)分成三組:正常對(duì)照組(Con)，生理鹽水組(STZ/Sal)和胰島素組(STZ/Ins)。給藥過程中監(jiān)測(cè)三組大鼠的體重和血糖，發(fā)現(xiàn)三組大鼠血糖的變化無明顯差異，生理鹽水組和胰島素組體重較正常對(duì)照組明顯減輕。
　　2.采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(Open Field，OF)，物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)（Object Recognition test，ORT）和水迷宮

5、測(cè)試(Morris Water Maze，MWM)來評(píng)估三組大鼠的自主活動(dòng)和認(rèn)知功能。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，ICV-STZ大鼠在曠場(chǎng)內(nèi)活動(dòng)經(jīng)過的距離比對(duì)照組明顯增加，表明其對(duì)環(huán)境的探究行為增加，經(jīng)鼻吸入胰島素后能降低該組大鼠的探究行為。物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，ICV-STZ大鼠探究新物體的時(shí)間顯著少于對(duì)照組，而胰島素組與對(duì)照組之間沒有明顯差別，表明ICV-STZ大鼠短時(shí)記憶受損。在MWM的獲得性訓(xùn)練(acquisition phase)中，三組大鼠的逃避

6、潛伏期（Escape latency）和游泳速度(Swim speed)無顯著差異;而在探查測(cè)驗(yàn)(probe trial)中，ICV-STZ大鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間和穿越原平臺(tái)的次數(shù)明顯低于對(duì)照組和胰島素組，提示胰島素能夠改善ICV-STZ大鼠的空間記憶損害。
　　3.我們用免疫印跡法檢測(cè)了經(jīng)鼻吸入胰島素對(duì)ICV-STZ大鼠腦內(nèi)tau蛋白磷酸化的影響。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，ICV-STZ大鼠腦內(nèi)tau蛋白多個(gè)位點(diǎn)磷酸化水平升高，如

7、Ser199/202， Thr205， Ser262和Ser396，而總tau蛋白（Tau-5）表達(dá)量沒有明顯變化。經(jīng)鼻吸入胰島素能夠顯著降低上述位點(diǎn)的磷酸化水平。Tau蛋白的磷酸化與其激酶和磷酸酶的活性有關(guān)。為了闡明胰島素降低tau過度磷酸化的機(jī)制，我們檢測(cè)了相關(guān)的激酶和磷酸酶的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)各組大鼠腦內(nèi)tau蛋白激酶總量無明顯差異。在ICV-STZ大鼠腦內(nèi)，糖原合成酶-3(glycogensynthase kinase-3，GS

8、K-3)、絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase,MAPK/ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)的磷酸化水平

9、明顯升高。吸入胰島素能夠?qū)SK-3、ERK1/2和CaMKⅡ的磷酸化水平降低到正常組水平。蛋白磷酸酶2(PP2A)是人腦內(nèi)最重要的tau的磷酸酶。我們沒有觀察到ICV-STZ大鼠腦內(nèi)PP2A-C蛋白水平和其活性的改變，胰島素治療對(duì)其也沒有影響。這些結(jié)果表明，經(jīng)鼻吸入胰島素降低ICV-STZ大鼠腦內(nèi)過度磷酸化的tau可能是通過下調(diào)ERK1/2和CaMKⅡ的活性實(shí)現(xiàn)的。
　　4.為了研究胰島素對(duì)神經(jīng)炎癥的影響，我們檢測(cè)了三組大鼠腦內(nèi)

10、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein， GFAP）和離子鈣接頭分子-1(ionizedCa2+-binding adaptor molecule-1，Iba1)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ICV-STZ大鼠腦內(nèi)GFAP和Iba1水平顯著增高，而胰島素能夠明顯抑制Iba1的表達(dá)。免疫組化的結(jié)果進(jìn)一步印證了以上結(jié)果。
　　5.我們還檢測(cè)了三組大鼠海馬新生神經(jīng)元標(biāo)記物doublecor

11、tin(DCX)和突觸前膜、突觸后膜相關(guān)蛋白水平的變化。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，ICV-STZ大鼠腦內(nèi)的DCX、突觸素(synaptophysin)、突觸蛋白1（synapsin1）和突觸后密度蛋白-95（PSD-95）表達(dá)水平無明顯差別。但是胰島素組的DCX水平確明顯高于對(duì)照組，此外，胰島素組的synapsin1水平高于生理鹽水組。
　　6.為了研究經(jīng)鼻吸入胰島素對(duì)腦胰島素信號(hào)通路的影響，我們檢測(cè)了通路上相關(guān)蛋白的表達(dá)水平和活性。

12、我們發(fā)現(xiàn)ICV-STZ大鼠腦內(nèi)IRS1和AKT pT308水平明顯升高，說明ICV-STZ大鼠腦內(nèi)存在一定的胰島素信號(hào)通路異常。吸入胰島素使ICV-STZ大鼠海馬內(nèi)升高的AKT pT308水平恢復(fù)到正常水平。
　　7.腦葡萄糖代謝降低是AD的一個(gè)重要的病理生理特征。為了評(píng)估經(jīng)鼻吸入胰島素是否會(huì)影響ICV-STZ大鼠的腦葡萄糖代謝，我們應(yīng)用microPET檢測(cè)了大鼠腦內(nèi)18F-氟脫氧葡萄糖(18F-FDG)的標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(SUVs)

13、。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，注射側(cè)ICV-STZ大鼠前額葉皮層、扣帶回、紋狀體、海馬和內(nèi)嗅皮層18F-FDG SUVs明顯降低。經(jīng)鼻吸入胰島素能夠明顯增加ICV-STZ大鼠前額葉皮層和扣帶回的8F-FDG SUVs。為了研究胰島素對(duì)各腦區(qū)神經(jīng)元的影響，接下來我們用免疫組化方法檢測(cè)了神經(jīng)元標(biāo)記物—NeuN在各腦區(qū)的表達(dá)。結(jié)果顯示ICV-STZ大鼠海馬的CA1、CA3區(qū)和紋狀體的陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組顯著減少。經(jīng)鼻吸入胰島素增加了ICV-STZ大

14、鼠海馬的CA1、CA3區(qū)的NeuN陽性細(xì)胞數(shù)，提示胰島素可以阻止ICV-STZ大鼠海馬內(nèi)的神經(jīng)元丟失。
　　結(jié)論:
　　本研究發(fā)現(xiàn)ICV-STZ大鼠存在認(rèn)知功能障礙，tau過度磷酸化，神經(jīng)炎癥。此外，我們還發(fā)現(xiàn)注射側(cè)ICV-STZ大鼠前額葉皮層、扣帶回、紋狀體、海馬和內(nèi)嗅皮層葡萄糖代謝顯著降低。經(jīng)鼻吸入胰島素6周可以明顯改善ICV-STZ大鼠的認(rèn)知功能，減輕腦內(nèi)tau蛋白的過度磷酸化和小膠質(zhì)細(xì)胞激活，增加海馬內(nèi)新生神經(jīng)元生成