SPK1對阿爾茨海默病細(xì)胞模型的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:探討鞘氨醇激酶-1(sphingosine kinase-1,SPK1)對β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的阿爾茨海默病細(xì)胞模型是否具有保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。
　　方法:(1)以β-淀粉樣肽片段25-35(amyloidβ-peptide fragment25-35,Aβ25-35)處理已分化的小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞(mouse Neuro-2a,N2a)作為阿爾茨海默病的細(xì)胞模型,將不同濃度的Aβ25-35加入培養(yǎng)的N2a細(xì)胞24h后通過四甲基

2、偶氮唑(MTT)法檢測細(xì)胞活性;Hoechst33258染色檢測細(xì)胞凋亡率;透射電鏡觀察細(xì)胞核的超微結(jié)構(gòu)。比較各組的差異。(2)將20μM的Aβ25-35加入培養(yǎng)的N2a細(xì)胞24h,應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測SPK1蛋白水平的表達(dá)變化。然后構(gòu)建腺病毒載體感染細(xì)胞干預(yù)SPK1的表達(dá),通過MTT法檢測細(xì)胞活性;Hoechst33258染色檢測細(xì)胞凋亡率;透射電鏡觀察細(xì)胞核的超微結(jié)構(gòu)。比較各組的差異,用以觀察調(diào)節(jié)SPK1水平對Aβ25-35誘導(dǎo)的神

3、經(jīng)毒性的影響。(3)應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測上述各組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá);應(yīng)用透射電鏡觀察上述各組線粒體超微結(jié)構(gòu)。比較各組的差異。
　　結(jié)果:(1)隨Aβ25-35濃度增加,細(xì)胞活性下降,細(xì)胞凋亡率增加,20μM的Aβ25-35處理分化的N2a細(xì)胞24h符合阿爾茨海默病細(xì)胞模型。(2)Aβ組與對照組相比,SPK1蛋白水平下降;Ad-SPK1+Aβ組與Aβ組相比,細(xì)胞活性增高,凋亡率下降;SPK1-siRNA+Aβ組與Aβ組相比,細(xì)胞活性下

4、降,凋亡率增高。(3)Aβ組與對照組相比,Bax/Bcl-2比例明顯增加,出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損壞的線粒體;Ad-SPK1+Aβ組與Aβ組相比,Bax/Bcl-2的比例下降,線粒體結(jié)構(gòu)明顯改善;SPK1-siRNA組與Vector組相比,Bax/Bcl-2的比例增高,出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損壞的線粒體。
　　結(jié)論:Aβ25-35誘導(dǎo)N2a細(xì)胞SPK1表達(dá)下降,上調(diào)SPK1的表達(dá)可以減輕Aβ25-35對N2a細(xì)胞的毒性損傷,其保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白B