環(huán)孢素A對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、我們近幾年在臨床上開展的腎活檢、皮膚活檢和肌肉活檢都證明，糖尿病人體內(nèi)存在廣泛的多器官免疫損傷。多年來，糖尿病的防治都是以高血糖為中心的治療策略，因此糖尿病的慢性并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)理和臨床處理都處于思想茫然和束手無策的尷尬境地。為弄清糖尿病發(fā)病機(jī)理，更好地從疾病的源頭預(yù)防和治療糖尿病及其并發(fā)癥，我們開展了糖尿病多器官的病理免疫學(xué)的研究并嘗試用環(huán)孢素A 進(jìn)行干預(yù)。本試驗(yàn)是整個(gè)研究的一部分。 第一部分 環(huán)孢素A對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大

2、鼠胰島功能障礙的作用 目的：建立鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型；觀察小劑量環(huán)孢素 A (CyclosporinA，CsA) 聯(lián)合胰島素治療對糖尿病大鼠胰島功能的保護(hù)作用以及CsA治療的副作用。 方法：雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為5組，即正常對照(CON)組；糖尿病對照(DM)組，不給予任何干預(yù)措施；單純胰島素治療(INS)組，予中效胰島素 8U/d 皮下注射；單純環(huán)孢素A治療(Cs

3、A)組，予環(huán)孢素A 1 mg/(kg．d)皮下注射；聯(lián)合治療(CpI)組，同時(shí)給予上述劑量的環(huán)孢素A和中效胰島素。干預(yù)4周后處死。每周監(jiān)測體重，定期監(jiān)測血糖，24 h尿微量白蛋白定量測定，4周時(shí)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)和胰島素激發(fā)試驗(yàn)(停用胰島素3日)，處死前取血檢測肝腎功能和電解質(zhì)。通過對胰腺組織的特殊染色(HE和AZON)、免疫組織化學(xué)胰島素抗體染色和透射電鏡檢測觀察大鼠胰島形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果：32只造模大鼠全部成模

4、。干預(yù)4周時(shí)，INS和CpI組隨機(jī)血糖明顯低于DM組，CpI 組隨機(jī)血糖低于CsA和INS組。CpI組大鼠胰島面積和胰島素蛋白表達(dá)均高于DM和CsA組，較INS 組有升高的趨勢(P值分別為0.056和0.057)。 OGTT結(jié)果。OGTT各點(diǎn)CpI和INS 組大鼠血糖都低于糖尿病組；CpI組大鼠空腹和120 min血糖與INs組無差別，30和60 min血糖低于INS組。 OGTT葡萄糖曲線下面積的結(jié)果為，DM組(70.

5、21±14.47)、INS組(50.21±8.79)、CpI組(38.72±3.98)和CON組(22.55±1.25)，組間差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。胰島素激發(fā)試驗(yàn)，CpI和INS組在高糖刺激下的胰島素釋放高于DM組；CpI組大鼠試驗(yàn)30和 60min血清胰島素水平高于INS組。β細(xì)胞功能指標(biāo)，CpI組60 min胰島素分泌指數(shù)(InsE<,60>)高于DM和INS組；Cpl組β細(xì)胞功能指數(shù)(HBCI)高于DM組，與INS組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

6、；各組糖尿病大鼠之間InsE<,30>無差別。 形態(tài)學(xué)觀察。光鏡HE、AZON染色和透射電鏡的研究結(jié)論一致，即CpI組β細(xì)胞結(jié)構(gòu)更接近于正常對照組結(jié)構(gòu)，胰島病變較INS組改善更加明顯。 生化檢查。CpI和INS組大鼠血清總膽紅素低于DM和CsA組；CpI組24h尿微量白蛋白低于DM和INS組；CpI和INS組尿素氮水平低于DM組，而CpI組血肌酐低于DM和INS組。 結(jié)論：①STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型成立；

7、②小劑量CsA(1mg.kg.d)具有對糖尿病大鼠胰島B細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)，這一作用需要外源性胰島素的輔助；③CsA對糖尿病大鼠的腎保護(hù)作用不僅僅依賴于血糖控制；④以1 mg/(kg.d)的CsA治療4周未造成糖尿病大鼠的肝。腎功能損害。 第二部分 環(huán)孢素A對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠免疫功能的作用 目的：在得到了小劑量CsA具有β細(xì)胞保護(hù)作用的結(jié)論后，本節(jié)繼續(xù)探討CsA對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠胰腺局部和相關(guān)淋巴結(jié)免疫功能的影

8、響。 方法：實(shí)驗(yàn)動物和分組同上。取液氮保存的胰腺組織，提取蛋白，SDS-PAGE蛋白電泳以考馬斯亮藍(lán)染色鑒定有無降解，以Western Blotting法鑒定胰腺組織中DCs特異性表面標(biāo)志物——CDlα的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果以β-actin的蛋白表達(dá)進(jìn)行校正。糖尿病組大鼠，依次取出胰腺引流淋巴結(jié)(PDIN)、腸系膜淋巴結(jié)(SLN)和脾臟的左側(cè)1/2，行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)；每組每個(gè)部位設(shè)立細(xì)胞對照孔和ConA(20 μg/mL) 刺激

9、孔各8復(fù)孔，胎牛血清濃度為10％。T淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)68h，離心并留上清備測IL-2；以含MTT的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4h，MTT比色法測定T淋巴細(xì)胞增殖活性。取PDIN來源的ConA刺激孔T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清測定IL-2濃度，IL-2測定采用雙抗體夾心ELISA法。 結(jié)果：胰腺CDlα的蛋白表達(dá)水平(較之β-actin)為，CON組(0.046±0.009)、DM組(1.895±0.268)、INS組 (1.565±0.261

10、)、CsA組(0.583±0.125)和CpI組(0.292±0.098)，總體及任意兩組間差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 針對糖尿病大鼠進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，臺盼蘭拒染實(shí)驗(yàn)活細(xì)胞數(shù)>98％；PDLN和SLN來源的DM組以及PDLN來源的INS組淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)顯著升高；PDLN和SLN來源的CsA和CpI組以及脾臟淋巴細(xì)胞SI均無明顯升高。 來源于PDLN的淋巴細(xì)胞在絲裂原刺激下IL-2分泌量的比較結(jié)果顯示，3個(gè)干預(yù)組

11、IL-2均低于DM組，CsA和ICpI組低于INS組，CsA和lCpI組之間無差別。各組之間差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)=48.197，P=0.000。 結(jié)論：①CsA和胰島素聯(lián)合治療在阻斷胰島局部DCs浸潤上效果最明顯，這可能是免疫抑制劑與胰島素雙重作用的結(jié)果；②PDLN是糖尿病大鼠自身免疫反應(yīng)啟動/擴(kuò)增的部位，CsA 可明顯抑制PDLN中T淋巴細(xì)胞的增殖活性，胰島素則無此作用；③CsA可抑制體外培養(yǎng)的PDLN來源的T淋巴細(xì)胞在絲裂

12、原刺激下IL-2的分泌，胰島素作用較弱。 第三部分 環(huán)孢素A對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞凋亡和前炎性細(xì)胞因子表達(dá)的作用 目的：前面已明確，小劑量CsA對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠的胰島β細(xì)胞功能具有保護(hù)效應(yīng)，并且對胰島局部和引流淋巴結(jié)的免疫反應(yīng)都具有抑制作用。本節(jié)探討小劑量CsA對STZ 誘導(dǎo)糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞凋亡的影響和炎性因子在其中發(fā)揮的作用。 方法：實(shí)驗(yàn)動物和分組同上。TUNEL法檢測胰島細(xì)胞凋亡，

13、并通過對連續(xù)切片胰島素蛋白表達(dá)的免疫組化檢測，鑒定凋亡的細(xì)胞為β細(xì)胞，計(jì)算β細(xì)胞凋亡率。通過以相應(yīng)細(xì)胞因子抗體對胰腺石蠟切片的免疫組織化學(xué)染色，測定前炎性細(xì)胞因子TNFα、IL-1β和 MCP-1 在胰島的蛋白表達(dá)，同時(shí)測定胰島面積，計(jì)算單位胰島面積上細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)量。提取胰腺總RNA，進(jìn)行完整性鑒定； T-A 克隆構(gòu)建含有目的片段的重組質(zhì)粒，制備標(biāo)準(zhǔn)模板；序列測定無誤后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測胰腺中TNFα、MCP-1和

14、凋亡蛋白Caspase-3 的 mRNA 水平，結(jié)果以B-actin進(jìn)行校正。 結(jié)果：TNFα的蛋白表達(dá)在DM和INS組高于正常對照組，CsA和CpI組低于DM和INS組，CsA和CpI組之間或DM和INS組之間TNFα水平無差別。TNFα的mRNA水平與其蛋白表達(dá)水平的趨勢一致，但CsA組與其它各組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 MCP-1 的蛋白水平和mRNA水平完全一致。糖尿病大鼠MCP-1的蛋白和基因表達(dá)均高于正常對

15、照組；CsA和Cpl組低 于DM和INS組；CsA和CpI組之間或DM和INS組之間MCP-1的蛋白和mRNA水平無差別。 IL-1β的蛋白表達(dá)結(jié)果為，DM、INS和CsA 組高于正常對照組，各干預(yù)組IL-1β蛋白表達(dá)均低于DM組；INS組和CpI組IL-1β的水平低于CsA組，前兩者之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 糖尿病大鼠β細(xì)胞凋亡率高于正常對照組；INS、CsA和CpI組較之DM組凋亡率降低；CpI組β細(xì)胞凋亡率低于INS

16、和CsA組，后二者之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。凋亡蛋白Caspase-3的mRNA 水平與β細(xì)胞凋亡率基本一致，僅CsA組與DM組之間無差別。 針對胰島β細(xì)胞凋亡率的多元相關(guān)和回歸分析顯示，與β細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)的是 Caspase-3 基因表達(dá)量、MCP-1 基因表達(dá)量、IL-1β蛋白表達(dá)量和4周隨機(jī)血糖；呈負(fù)相關(guān)的是大鼠4周體重。在回歸分析中，先后進(jìn)入方程的是Caspase-3基因表達(dá)量(R<'2>=0．620)和IL-1 β蛋白

17、表達(dá)量(累積R<'2>=0．680)。 結(jié)論：①小劑量CsA(1mg．kg．d)使糖尿病大鼠胰腺凋亡蛋白Caspase-3基因表達(dá)量下降、胰島β細(xì)胞凋亡減少，這是CsA保護(hù)胰島功能的有力證據(jù)；②無論在mRNA 水平還是蛋白水平上，糖尿病大鼠胰腺中細(xì)胞因子 TNFFα、IL-1B和MCP-1表達(dá)都呈上調(diào)趨勢；③CsA與胰島素聯(lián)合治療可抑制前炎性細(xì)胞因子在胰腺的高表達(dá)；其中，免疫抑制劑對TNFα和MCP-1的影響較大，而IL-1β蛋