雙基因NGF-IREs-BMP2真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs誘導(dǎo)成骨的實驗研究.pdf

1、目的：運用基因工程的手段將雙基因真核質(zhì)粒載體pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2轉(zhuǎn)染入大鼠BMSCs中，研究其誘導(dǎo)成骨后目的蛋白的表達情況。
　　方法：取三月齡SD大鼠，頸椎脫臼處死后，通過全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs并穩(wěn)定傳代。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長形態(tài)，運用流式細胞儀檢測大鼠BMSCs表面標(biāo)志物CD31、CD90。取第三代大鼠BMSCs，分為五組，單基因pCDNA3.1-NGF轉(zhuǎn)染組（A組），單基因pCDN

2、A3.1-BMP2轉(zhuǎn)染組（B組），雙基因pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2轉(zhuǎn)染組（C組），空質(zhì)粒組（D組），陰性對照組（E組）。運用Lipofectamine2000介導(dǎo)將各組基因轉(zhuǎn)染入大鼠BMSCs。western-blot檢測目的基因蛋白表達情況，并用BioRad凝膠圖像分析系統(tǒng)測定各組灰度值。免疫組織化學(xué)染色檢測I型膠原蛋白表達含量。茜蘇紅染色測定各組BMSCs鈣結(jié)節(jié)并計數(shù)。數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：顯微鏡觀

3、察BMSCs成功分離培養(yǎng)并穩(wěn)定傳代;流式細胞儀測定BMSCs表面標(biāo)志物，CD90表達陽性，CD31表達陰性;各組基因轉(zhuǎn)染BMSCs后，western-blot、I型膠原免疫組化染色、茜蘇紅染色鈣結(jié)節(jié)及統(tǒng)計學(xué)分析均提示雙基因轉(zhuǎn)染組的目的蛋白表達量、I型膠原蛋白表達量、鈣結(jié)節(jié)形成數(shù)目均高于單基因轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒組以及陰性對照組。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果p＜0.05，有顯著性差異。
　　結(jié)論：轉(zhuǎn)染雙基因pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2組