骨折后不同代次大鼠BMSCs體外共培養(yǎng)及其成骨誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討骨折后不同代次大鼠 BMSCs在體外共培養(yǎng)條件下的增殖及成骨能力的實(shí)驗(yàn)研究。
　　方法：①3月齡雄性大鼠15只,制作骨折及骨折后內(nèi)固定模型，分別于術(shù)后1 d、1w、2w行大X線檢查骨折愈合及克氏針在位情況。②取喂養(yǎng)2w大鼠骨折端BMSCs，進(jìn)行原代、傳1代、傳2代、傳3代體外增殖培養(yǎng)，將原代及傳代培養(yǎng)的BMSCs分別編號(hào)為 P0、P1、P2、P3，將單代次BMSCs設(shè)為對(duì)照組，編為第I組。③將不同2代次培養(yǎng)設(shè)為第II組，

2、同理，將3種不同代次BMSCs共培養(yǎng)設(shè)為第III組,將4種不同代次BMSCs設(shè)為第IV組，進(jìn)行體外共培養(yǎng)。④各組BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)8天，每天行MTT檢測(cè)并其繪制其生長(zhǎng)曲線。⑤各組BMSCs成骨誘導(dǎo)分化3周后，進(jìn)行堿性磷酸酶染色同時(shí)行堿性磷酸酶活性檢測(cè)、茜素紅染色并鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)及Western Blot檢測(cè)BMP-2蛋白含量。⑥分別進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：①骨折模型制作成功，在術(shù)后1d、1w、2w的X線檢測(cè)中，克氏針均在位，骨

3、折無(wú)明顯愈合跡象。②倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)：各組 BMSCs生長(zhǎng)均呈放射狀集落貼壁生長(zhǎng)，共培養(yǎng)組細(xì)胞在鏡下觀察有各代細(xì)胞，形態(tài)不一。③ MTT法檢測(cè)生長(zhǎng)情況：各組在開(kāi)始24小時(shí)各組均出現(xiàn)生長(zhǎng)滯緩期，差異較小，24小時(shí)后，IV組細(xì)胞開(kāi)始大量增殖，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)速率較快，持續(xù)約3天，最早到達(dá)峰值，保持較高水平約48小時(shí)，然后緩慢下降；隨著組合細(xì)胞代次的減少，增殖數(shù)量由高到低，平臺(tái)期持續(xù)時(shí)間逐漸縮短，衰竭期下降速率由慢到快。④各組

4、BMSCs細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，排列呈魚群樣，生長(zhǎng)旺盛，形體飽滿，體積逐漸增大。⑤堿性磷酸酶化學(xué)染色：所有組別BMSCs成骨誘導(dǎo)后均能被染色，成骨細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)棕褐色陽(yáng)性顆粒。⑥堿性磷酸酶活性檢測(cè)：I、II、III、IV多組作單因素方差分析，2d、4d、6d無(wú)明顯差異，第8d見(jiàn) III組為27.25±0.45、IV組為29.56±0.52與 I組25.19±0.80相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。⑦各組BMSCs成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色檢測(cè)均呈陽(yáng)性反應(yīng)

5、，出現(xiàn)橘紅色鈣結(jié)節(jié)，提示成骨誘導(dǎo)成功。⑧鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)提示：共培養(yǎng)組BMSCs的鈣結(jié)節(jié)大而多I-IV組鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)分別為：31.50±1.50、33.43±1.14、34.85±1.48、34.12±2.76，II、III、IV組與I組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而共培養(yǎng)組內(nèi)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。⑨ Western Bolt檢測(cè)發(fā)現(xiàn)I-IV組BMP-2蛋白含量依次增加，分別為0.694±0.080、0.741±0.469、0.832±0.035、0.935