地塞米松對體外培養(yǎng)的人牙囊細胞成骨特性影響的實驗研究.pdf

1、牙囊是牙齒萌出前的牙胚中圍繞造釉器和牙乳頭的疏松外胚間充質(zhì)組織。牙囊中含有形成牙周組織的前體細胞，在牙齒的發(fā)育過程中形成牙骨質(zhì)、牙周膜和固有牙槽骨。目前認為牙囊靠近發(fā)育中的牙根的最內(nèi)層發(fā)育為成牙骨質(zhì)細胞，形成牙骨質(zhì)；靠近牙槽骨的外層細胞分化為成骨細胞分泌骨基質(zhì)；中間層發(fā)育為成纖維細胞并產(chǎn)生牙周膜的細胞外基質(zhì)。由生長因子和細胞分子組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制牙囊細胞的發(fā)育和功能。牙骨質(zhì)的形成依靠牙根的形成，牙根形成開始于內(nèi)釉上皮和外釉上皮增殖形成的

2、Hertwig's上皮根鞘，來源于上皮根鞘的刺激開始了牙囊前體細胞向成牙骨質(zhì)細胞的分化。這些刺激物包括釉基質(zhì)蛋白、層粘連蛋白、I型膠原和轉(zhuǎn)化生長因子β超家族等。 目前對于牙囊細胞的成骨特性研究集中于以下方面：1.體外培養(yǎng)培養(yǎng)牙囊細胞在體外的礦化和和體內(nèi)成骨實驗研究以及在此過程中的相關(guān)基因表達；2.胰島素、地塞米松和BMP-2誘導(dǎo)下牙囊細胞向成骨細胞分化過程中，OCN、BMP-2、Cbfa1、DLX-5、MSX-2等基因的mRNA

3、的表達。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)了許多對成骨細胞有影響的因素，其中包括多種生長因子如：骨形成蛋白(BMPs)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、成纖維細胞生長因子(FGFs)、胰島素樣生長因子(IGFs)、血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)，它們在促進成骨細胞增殖、分化，促進成骨細胞合成細胞外基質(zhì)等方面起重要作用。在成骨細胞的分化過程中，與成骨相關(guān)的基因如骨鈣蛋白、骨涎蛋白、膠原等的表達也相應(yīng)發(fā)生變化。因此，研究牙囊細胞在成骨分化

4、的過程中，哪些因子參與了其中的過程，以及在分化過程中哪些基因發(fā)生變化都是非常重要的。本研究應(yīng)用細胞培養(yǎng)、基因芯片以及PCR等實驗方法研究地塞米松對人牙囊細胞體外礦化的影響、地塞米松對人牙囊細胞中與成骨相關(guān)的96個基因表達的變化，初步探討人牙囊細胞向成骨細胞分化過程的機制，為進一步研究牙囊細胞向成骨細胞分化的研究提供基礎(chǔ)。本研究的內(nèi)容如下： 1.人牙囊細胞的體外培養(yǎng)及鑒定 目的：探討人牙囊細胞體外培養(yǎng)的新方法，為進一步研究

5、牙囊細胞的生物學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。方法：取自12-13歲患者因正畸需要拔除的下頜第三磨牙牙冠以下部分的牙囊，采用組織塊和酶消化相結(jié)合的方法體外培養(yǎng)原代牙囊細胞，并對牙囊細胞進行鑒定。結(jié)果：接種72h可見經(jīng)消化松散貼壁的組織塊周圍有細胞呈放散狀爬出，細胞形態(tài)呈長梭形，組織塊周圍細胞亦生長旺盛。培養(yǎng)的人牙囊細胞生長爬滿需要14天左右。培養(yǎng)的人牙囊細胞呈梭形、紡錘形或多角形，具有成纖維細胞特性。波絲蛋白細胞染色陽性。結(jié)論：組織塊酶消化法培養(yǎng)細胞，

6、細胞易于爬出，提高了培養(yǎng)的速度。 2.地塞米松對人牙囊細胞增殖的影響 目的：探討地塞米松對體外培養(yǎng)的人牙囊細胞增殖的影響，為進一步研究地塞米松對人牙囊細胞的作用奠定基礎(chǔ)。方法：在培養(yǎng)液中加入不同濃度的的地塞米松(0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)，用四唑鹽(MTT)比色法觀察地塞米松對人牙囊細胞增殖影響的濃度效應(yīng)，用10-8mol/L地塞米松作用于人牙囊細胞，用MTT法觀察地塞米松對牙囊細

7、胞增殖的時間效應(yīng)。結(jié)果：1.10-10、10-9mol/L的地塞米松對牙囊細胞的增殖沒有影響(P＜0.01)，而10-8、10-7、10-6mol/L的地塞米松對牙囊細胞的增殖有抑制作用(P＜0.01)。2.10-8mol/L地塞米松作用于牙囊細胞，牙囊細胞的增殖隨時間延長而逐漸升高，其生長曲線仍呈上升趨勢。結(jié)論：低濃度的地塞米松對牙囊細胞的增殖沒有影響，高濃度的地塞米松抑制牙囊細胞的增殖。10-8mol/L地塞米松作用于牙囊細胞，牙囊

8、細胞的增殖隨時間逐漸升高。 3.地塞米松對體外培養(yǎng)的人牙囊細胞中堿性磷酸酶活性和體外礦化的的影響 目的：觀察不同濃度的地塞米松對體外培養(yǎng)的人牙囊細胞體外分化的影響。方法：以不同濃度(0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)的地塞米松作為誘導(dǎo)劑，進行堿性磷酸酶(ALP)活性檢測。用含有10-8mol/L地塞米松、50mg/LL-抗壞血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的條件培養(yǎng)液長期培養(yǎng)人牙囊細胞

9、，觀察對體外礦化的影響。結(jié)果：1.10-9、10-8、10-7、10-6mol/L的地塞米松增強牙囊細胞堿性磷酸酶的表達，與空白對照組均有顯著性差異，隨著地塞米松濃度的增加，堿性磷酸酶活性增強，不同濃度間具有顯著性差異(P＜0.05)。10-8mol/L的地塞米松作用于牙囊細胞，其堿性磷酸酶的表達，從第3天開始升高，第7、9天達到最高。2.牙囊細胞在條件礦化液中培養(yǎng)4周，產(chǎn)生礦化結(jié)節(jié)。結(jié)論：地塞米松能夠升高體外培養(yǎng)的人牙囊細胞的堿性磷酸

10、酶的活性，并呈現(xiàn)劑量依賴性，10-8mol/L地塞米松對牙囊細胞堿性磷酸酶活性的影響隨著時間的延長而升高，呈現(xiàn)時間依賴性；牙囊細胞在體外具有礦化能力。 4.地塞米松對人牙囊細胞成骨相關(guān)基因表達的影響 目的：檢測人牙囊細胞在體外條件下向成骨細胞分化時生長因子及成骨相關(guān)基因表達的變化，初步探討牙囊細胞體外分化的機制。方法：牙囊細胞用含10-8mol/L地塞米松的培養(yǎng)液長期體外培養(yǎng)4周，對照組不加地塞米松。然后用基因芯片技術(shù)檢

11、測地塞米松對牙囊細胞中成骨相關(guān)基因的表達變化。結(jié)果：地塞米松作用后的牙囊細胞中，有28個基因的表達發(fā)生變化，其中20個基因表達上調(diào)，8個基因表達下調(diào)。它們分別屬于生長因子和相關(guān)蛋白、基質(zhì)和相關(guān)蛋白，細胞粘附分子未見明顯變化。結(jié)論：地塞米松能改變?nèi)搜滥壹毎?8個成骨相關(guān)基因的表達水平。 5.基因芯片的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)驗證 目的：初步驗證基因芯片結(jié)果的可靠性。方法：人牙囊細胞用含10-8mol/L地塞米松的培養(yǎng)液長期體外

12、培養(yǎng)4周，對照組不加地塞米松。然后用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測地塞米松對牙囊細胞中OCN、BMP-2、Smad7mRNA的表達變化。結(jié)果：地塞米松作用后的牙囊細胞中OCN、BMP-2mRNA的表達上調(diào)，Smad7mRNA的表達下調(diào)。結(jié)論：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測初步證明了基因芯片技術(shù)的可靠性。 6.地塞米松對牙囊細胞中OCN、Cbfa1mRNA表達的影響 目的：探討Cbfa1在牙囊細胞向成骨細胞分化過程中的調(diào)控作用。方

13、法：用含10-8mol/L地塞米松的培養(yǎng)液體外培養(yǎng)牙囊細胞0、7、14、21、28天。對照組不加地塞米松。然后用Real-timePCR技術(shù)檢測地塞米松對牙囊細胞中Cbfa1、OCNmRNA表達的變化。結(jié)果：地塞米松作用后的牙囊細胞中Cbfa1mRNA的表達從第7天開始升高，第14天達到最高水平，第21、28天逐漸降低；OCNmRNA的表達從第14天開始升高，到28天明顯升高。結(jié)論：Cbfa1在啟動人牙囊細胞向成骨細胞分化的過程中發(fā)揮了