2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景:
  股骨頭壞死(Osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是指股骨頭內(nèi)由于缺血改變造成股骨頭內(nèi)骨髓和骨細(xì)胞的變化,引起股骨頭結(jié)構(gòu)、功能的改變,導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)受限的疾病,股骨頭壞死同時具有極高的致殘率。根據(jù)不同病因,可將股骨頭壞死分為非創(chuàng)傷性和創(chuàng)傷性股骨頭壞死,創(chuàng)傷性 ONFH的病因包括明確的外傷史,是由外部條件造成的,而非創(chuàng)傷性 ONFH又分為激素性股骨頭壞死、酒精性股骨頭壞死以及非特異

2、性股骨頭壞死。其中,由于臨床工作中治療其他疾病廣泛應(yīng)用激素,造成激素性 ONFH發(fā)生的發(fā)病率占第一位,大部分患者往往合并有其他疾病,并且累及雙側(cè)股骨頭發(fā)病,造成髖關(guān)節(jié)的嚴(yán)重受損,對患者的日常生活造成很大的影響。目前,關(guān)于激素性股骨頭壞死發(fā)病的病理機(jī)制并不完全清楚,觀點各不相同,國內(nèi)外尚無有效的預(yù)防激素性股骨頭壞死的方法。
  miRNA對于干細(xì)胞分化影響的研究開始逐漸明朗,然而,miRNA與股骨頭壞死關(guān)系的研究才剛剛開始,國內(nèi)外的

3、相關(guān)研究中關(guān)于運(yùn)用miRNA雙靶向基因調(diào)控的作用來預(yù)防和治療激素性股骨頭壞死的報道尚未見到。因此,本研究利用激素誘導(dǎo)大鼠模型,使用 miRNA芯片檢測的方法全面分析激素誘導(dǎo)對于miRNA表達(dá)的影響,從中選取了與股骨頭壞死較為密切的miRNA-27a進(jìn)行研究。同時,又根據(jù)生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)成脂基因PPARγ和成骨基因BMP-2拮抗劑GREM1均為miRNA-27a的靶基因。本研究希望通過調(diào)控miRNA-27a的表達(dá)靶向調(diào)控PPARγ和G

4、REM1的表達(dá),在有效的降低由于激素誘導(dǎo)產(chǎn)生的成脂分化作用的同時,促進(jìn)其主動的成骨分化作用,對股骨頭壞死初始環(huán)節(jié)的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行調(diào)控干預(yù)。所以,運(yùn)用miRNA雙靶向基因調(diào)控的作用,達(dá)到預(yù)防和治療激素性股骨頭壞死的科學(xué)研究更加具有創(chuàng)新意義。
  研究目的:
  通過上調(diào)miRNA-27a的表達(dá),靶向下調(diào)PPARγ和GREM1的表達(dá),觀察其對于激素誘導(dǎo)大鼠BMSCs產(chǎn)生的成脂分化和成骨分化作用的影響。
  本實驗研究由下三個

5、部分組成:
  第一部分:激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭壞死中特異表達(dá)的miRNA分析
  方法:
 ?。?)動物模型的建立:取SPF級雌性SD大鼠30只,隨機(jī)分為模型組與對照組。模型組連續(xù)肌肉注射地塞米松磷酸鈉(10mg/kg)。4周時取股骨頭行常規(guī)石蠟包埋切片HE染色。
 ?。?)ONFH特異表達(dá)miRNA篩選:兩組大鼠隨機(jī)各取3個樣本進(jìn)行miRNA基因芯片分析。
 ?。?)miRNA基因芯片結(jié)果驗證和相關(guān)基因表達(dá)

6、檢測:使用qRT-PCR檢測激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭壞死模型中 miRNA-27a和 miRNA-182的表達(dá)水平,以及PPARγ、GREM1的mRNA表達(dá)水平,并對miRNA-27a與PPARγ和GREM1的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性進(jìn)行分析。
 ?。?)采用SPSS21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
  結(jié)果:
  (1)4周時 HE染色,結(jié)果顯示:激素誘導(dǎo)模型組股骨頭內(nèi)骨小梁變細(xì),稀疏、斷裂、排列紊亂,骨小梁面積明顯

7、減少;正常對照組股骨頭內(nèi)骨小梁結(jié)構(gòu)完整,無斷裂。
 ?。?)miRNA基因芯片檢測結(jié)果顯示:激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭壞死模型組與對照組相比較,miRNA表達(dá)明顯上調(diào)達(dá)3倍以上的有9個,表達(dá)明顯下調(diào)達(dá)3倍以下的有28個。
 ?。?)qRT-PCR檢測結(jié)果顯示:miRNA-27a的表達(dá)在模型組中明顯下調(diào), miRNA-182則明顯上調(diào)(P<0.05)。
 ?。?)與對照組比較,模型組的PPARγ和GREM1的mRNA表達(dá)水平均明

8、顯上調(diào)(P<0.05)。
  (5)相關(guān)性分析結(jié)果顯示:PPARγ和 GREM1的表達(dá)水平與 miRNA-27a均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(R2=0.717、R2=0.662)。
  第二部分:上調(diào)miRNA-27a對激素誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響
  方法:
 ?。?)大鼠 BMSCs制備:分離培養(yǎng)大鼠 BMSCs,流式細(xì)胞儀行表面抗原CD29,CD34、CD45、CD90鑒定。
  (2)激素誘導(dǎo)BMSCs分

9、化實驗:對激素誘導(dǎo)大鼠BMSCs進(jìn)行油紅―O‖染色,檢測甘油三酯的含量,檢測骨鈣素含量及細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性。分別用qRT-PCR和Western blot檢測激素誘導(dǎo)大鼠BMSCs中與成脂、成骨相關(guān)蛋白PPARγ、GREM1、Runx2、BMP-2、C/EBPα的表達(dá)水平。
 ?。?)miRNA-27a影響激素誘導(dǎo)BMSCs分化實驗:轉(zhuǎn)染miRNA-27a agomir上調(diào)激素誘導(dǎo)大鼠BMSCs中miRNA-27a的表

10、達(dá)水平,qRT-PCR檢測大鼠BMSCs中miRNA-27a的表達(dá)水平;分別用qRT-PCR和Western blot檢測大鼠BMSCs中與成脂、成骨相關(guān)蛋白PPARγ、GREM1、Runx2、BMP-2、C/EBPα的表達(dá)水平。對上調(diào)miRNA-27a的BMSCs進(jìn)行油紅―O‖染色以及堿性磷酸酶染色,檢測甘油三酯的含量、骨鈣素含量及細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性。
  (4)采用SPSS21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析

11、。
  結(jié)果:
 ?。?)流式細(xì)胞儀術(shù)結(jié)果顯示:第3代大鼠BMSCs的CD29、CD90的陽性率為99.84%、99.41%;CD34、CD45的陽性率為1.29%、1.42%。
 ?。?)激素誘導(dǎo)BMSCs分化實驗結(jié)果顯示:激素誘導(dǎo)大鼠BMSCs14天,模型組BMSCs的油紅 O染色出現(xiàn)大量脂滴。模型組中的甘油三酯含量在7天和14天時均明顯高于正常對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組中的
  堿性

12、磷酸酶及細(xì)胞培養(yǎng)基中骨鈣素含量在7天和14天時均明顯低于正常對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)激素誘導(dǎo)的模型組大鼠 BMSCs在7天和14天時PPARγ、GREM1、C/EBPα的表達(dá)顯著高于正常對照組,且兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Runx2、BMP-2的表達(dá)和miRNA-27a的表達(dá)均明顯低于正常對照組,且兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
 ?。?)miRNA-27a影響激素誘導(dǎo)BMSCs分化實

13、驗結(jié)果顯示:在模型組和無關(guān)對照組中PPARγ、GREM1和C/EBPα的表達(dá)均顯著高于miRNA-27a組和正常組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);在模型組和無關(guān)對照組中Runx2、BMP-2的表達(dá)則顯著高于其他兩組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組和無關(guān)對照組的大鼠BMSCs油紅O染色中可見大量脂滴,而miRNA-27a組和正常對照組中量均極少。miRNA-27a組和正常對照組的大鼠BMSCs堿性磷酸酶(ALP)染色中均

14、可見大量細(xì)胞胞漿染色為藍(lán)/紫色,而模型組和無關(guān)對照組中量均極少。miRNA-27a組和正常對照組的大鼠BMSCs的甘油三酯含量均明顯低于模型組和無關(guān)對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。miRNA-27a組和正常對照組的大鼠BMSCs的堿性磷酸酶活性(ALP)及骨鈣素含量均明顯高于模型組和無關(guān)對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
  第三部分:miRNA-27a調(diào)控激素誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化機(jī)制的初步研究

15、>  方法:
 ?。?)生物信息學(xué)分析預(yù)測靶基因:用TargetScan和miRBase軟件分析預(yù)測miR-27a的靶基因。
 ?。?)miRNA-27a靶基因鑒定:構(gòu)建pmirGLO-PPARγ和pmirGLO-GREM1重組報告基因載體,與轉(zhuǎn)染miRNA-27a agomir與miRNA-27a scramble共轉(zhuǎn)染入大鼠BMSCs中,通過雙熒光素酶報告證實miRNA-27a的作用靶標(biāo)。
 ?。?)上調(diào)miRNA

16、-27a與沉默靶基因?qū)に卣T導(dǎo)BMSCs分化作用比較:實驗分為5組,為空白組(大鼠BMSCs);模型組(大鼠BMSCs+地塞米松);miRNA-27a組(miRNA-27a轉(zhuǎn)染BMSCs+地塞米松);si-PPARγ組(si-PPARγ轉(zhuǎn)染BMSCs+地塞米松);si-GREM1組(si-GREM1轉(zhuǎn)染BMSCs+地塞米松)。分組轉(zhuǎn)染24小時后, qRT-PCR檢測miRNA-27a的表達(dá)水平。BMSCs培養(yǎng)14天,分別用qRT-PCR

17、和Western blot檢測各組大鼠BMSCs中與成脂、成骨相關(guān)蛋白PPARγ、GREM1、Runx2、BMP-2、C/EBPα的表達(dá)水平。BMSCs培養(yǎng)14天,對各組 BMSCs進(jìn)行油紅―O‖染色和堿性磷酸酶染色;進(jìn)行甘油三酯測定檢測;ELISA檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)基中骨鈣素含量以及細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性。
 ?。?)采用SPSS21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
  結(jié)果:
 ?。?) TargetScan和

18、 miRBase生物信息學(xué)分析預(yù)測結(jié)果顯示:PPARγ和GREM1是miRNA-27a的作用靶點。
 ?。?)雙熒光素酶報告實驗的結(jié)果顯示:miR-27a通過作用于 PPARγ和GREM1的3' UTR區(qū),可以到達(dá)負(fù)向調(diào)控其表達(dá)的作用。
  (3)大鼠 BMSCs轉(zhuǎn)染 miRNA-27a的鑒定結(jié)果示:miRNA-27a組中miRNA-27a表達(dá)水平顯著增高,并明顯高于其他4組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
  

19、(4)BMSCs培養(yǎng)14天,模型組和si-GREM1組中PPARγ的表達(dá)均顯著高于正常組、si-PPARγ組和miRNA-27a組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);模型組和 si-PPARγ組中 GREM1的表達(dá)顯著高于正常組、si-GREM1組和miRNA-27a組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);空白組、si-GREM1組和miRNA-27a組中Runx2的表達(dá)則明顯高于si-PPARγ組和模型組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0

20、.05);模型組和si-PPARγ組中BMP-2的表達(dá)明顯低于正常組、si-GREM1組和 miRNA-27a組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);模型組和si-GREM1組中C/EBPα的表達(dá)顯著高于正常組、si-PPARγ組和miRNA-27a組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
  (5)BMSCs培養(yǎng)14天,油紅―O‖染色顯示:模型組和si-GREM1組的大鼠BMSCs中可見大量脂滴。而正常對照組、si-PPARγ組

21、和miRNA-27a組中量均極少。堿性磷酸酶染色顯示:正常對照組、si-GREM1組和 miRNA-27a組的大鼠BMSCs可見大量細(xì)胞胞漿染色為藍(lán)/紫色,而模型組和si-PPARγ組中量均極少。
 ?。?)BMSCs培養(yǎng)14天,正常組、si-PPARγ組和miRNA-27a組的大鼠BMSCs的甘油三酯含量均明顯低于模型組和si-GREM1組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
 ?。?)BMSCs培養(yǎng)14天,正常組、si

22、-GREM1組和 miRNA-27a組的大鼠BMSCs的堿性磷酸酶活性(ALP)及細(xì)胞培養(yǎng)基中骨鈣素含量均明顯高于模型組和si-PPARγ組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
  結(jié)論:
 ?。?)激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭壞死模型中,miRNA-27a的表達(dá)是顯著下調(diào)的, PPARγ和GREM1的表達(dá)明顯上調(diào),并且miRNA-27a的表達(dá)與PPARγ和GREM1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。
 ?。?)上調(diào)miRNA-27a的表達(dá)可

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