抑制Evi1基因表達(dá)促進(jìn)BMSCs成骨分化治療骨質(zhì)疏松癥的研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞、導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。隨人類(lèi)壽命的延長(zhǎng)和社會(huì)老年化的到來(lái)，骨質(zhì)疏松癥已成為人類(lèi)重要的健康問(wèn)題。
　　目前對(duì)骨質(zhì)疏松的治療措施主要分為基礎(chǔ)措施和藥物治療兩個(gè)方面?；A(chǔ)治療措施中主要是補(bǔ)充鈣劑和維生素D。藥物治療主要包括抗骨吸收藥物、促骨形成藥物和其他藥物。但由于對(duì)骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制并不完全清楚，所以當(dāng)前對(duì)于骨質(zhì)疏松的治療并不理想。因此

2、，進(jìn)一步研究骨質(zhì)疏松形成機(jī)制以及尋求更好的治療方法，降低骨折發(fā)病率和提高生活質(zhì)量是當(dāng)前骨質(zhì)疏松治療研究的重點(diǎn)。
　　骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制有很多，目前也取得了很多進(jìn)展。近年來(lái)有越來(lái)越多的證據(jù)證明骨質(zhì)疏松與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的相對(duì)缺乏相關(guān)；而且大量的研究發(fā)現(xiàn)患有骨質(zhì)疏松的絕經(jīng)期女性與正常女性相比不但常常伴有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化能力的降低，同時(shí)伴有骨髓組織中脂肪成分的增加。那么也就是說(shuō)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化能力的增加也可能是骨質(zhì)疏

3、松的發(fā)病機(jī)制。是不是抑制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化就能在一定程度上緩解骨質(zhì)疏松的進(jìn)程。
　　要抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪分化，我們首先要明確骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的關(guān)健調(diào)控因素。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)異位病毒整合位點(diǎn)1（ectopic viral integration site，Evi1）是前脂肪細(xì)胞3T3-L1分化為成熟脂肪細(xì)胞的決定因素；干擾該基因的表達(dá)則會(huì)阻斷3T3-L1細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化的進(jìn)程。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以分成為脂

4、肪細(xì)胞，也可視為一種前脂肪細(xì)胞，異位病毒整合位點(diǎn)也應(yīng)該會(huì)決定其向脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程。基于以上，提出三點(diǎn)假設(shè)：在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂肪分化過(guò)程中存在Evi1基因的表達(dá)；Evi1基因決定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂肪分化；抑制Evi1基因的表達(dá)可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化。
　　本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面對(duì)以上問(wèn)題展開(kāi)了研究工作，研究?jī)?nèi)容主要包括以下四個(gè)部分：
　　1、提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定。

5、　　2、在干細(xì)胞成脂分化過(guò)程中研究Evi1基因的表達(dá)以及如何表達(dá)。
　　3、構(gòu)建腺病毒載體，采用RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并測(cè)定其干擾效率和干擾作用。
　　4、制作大鼠骨質(zhì)疏松模型，通過(guò)尾靜脈注射腺病毒轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察對(duì)骨質(zhì)疏松的治療效果。
　　第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　目的：
　　學(xué)習(xí)并掌握大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)技術(shù)，并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞

6、表面標(biāo)記物、成骨成脂誘導(dǎo)分化的鑒定。為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)提供研究基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　雌性SPF級(jí)Sprague Dawley（SD）大鼠，體重100-120g,由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。
　　2．大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的原代分離培養(yǎng)
　　5％水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠，無(wú)菌條件下快速取大鼠的股骨及脛骨

7、，去除肌肉等軟組織，PBS清洗干凈。剪掉長(zhǎng)骨的骨骺端，露出骨髓腔，用含有100U/ml青、鏈霉素和10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，直至骨質(zhì)發(fā)白；將沖出的骨髓內(nèi)容物分置于培養(yǎng)瓶中，每只動(dòng)物骨髓可接種兩個(gè)T25培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。
　　3.BMSCs的培養(yǎng)、純化及傳代
　　在原代培養(yǎng)過(guò)程中，24小時(shí)后更換全部培養(yǎng)基，以后每周更換兩次完全培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)皿約90%時(shí)，使用胰酶-EDTA溶

8、液消化，1:4/5的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
　　4.BMSCs的形態(tài)學(xué)檢查
　　培養(yǎng)后使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化以及生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行拍照。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)
　　取第3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好BMSCs，胰酶-EDTA溶液消化，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞，依次在各管中加入單克隆抗體 CD34, CD44, CD45和CD904℃條件下孵育30分鐘，用PBS液洗滌細(xì)胞3次，以

9、除去未結(jié)合抗體，與FITC標(biāo)記和PE標(biāo)記的二抗避光作用30分鐘，再用PBS液重懸細(xì)胞并置于冰上，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。
　　6. BMSCs的成骨成脂誘導(dǎo)分化能力
　　取第3代生長(zhǎng)良好的BMSCs，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至細(xì)胞密度達(dá)80-90%時(shí)，在各誘導(dǎo)孔的完全培養(yǎng)液中分別加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑和成脂細(xì)胞誘導(dǎo)劑，各誘導(dǎo)孔每3-4天換液1次，同時(shí)設(shè)置L-DMEM完全培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)孔作為空白對(duì)照。成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑

10、誘導(dǎo)16天后，室溫下4%多聚甲醛固定10分鐘，對(duì)誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色；成骨誘導(dǎo)時(shí)細(xì)胞密度要求達(dá)到100%，成脂細(xì)胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)21天后，4%多聚甲醛固定，對(duì)誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色。倒置顯微鏡下觀察并拍照。
　　結(jié)果：
　　1.BMSCs的形態(tài)學(xué)觀測(cè)
　　SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)主要呈梭形細(xì)胞，細(xì)胞集落呈放射狀排列，細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好，可穩(wěn)定傳代20代以上。
　　2.BMSCs表面標(biāo)記物的表達(dá)

11、r>　　SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD44、CD90均呈陽(yáng)性表達(dá)，而CD34、CD45呈陰性表達(dá)。
　　3.BMSCs成骨成脂誘導(dǎo)分化鑒定
　　經(jīng)成骨、成脂誘導(dǎo)分化后，分別用茜素紅染色和油紅O染色均呈陽(yáng)性。
　　結(jié)論：
　　全骨髓貼壁培養(yǎng)法操作步驟簡(jiǎn)單，能夠大量分離、純化、擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得的細(xì)胞具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性，經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后有成骨和成脂分化潛能。
　　第二部分 Evi1基

12、因在骨髓干細(xì)胞成脂分化中的表達(dá)
　　目的：
　　在體外通過(guò)成熟的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)其成脂分化，使用PCR和Western blotting方法檢測(cè)Evi1基因的表達(dá)。
　　方法：
　　1.細(xì)胞
　　傳至第3代全骨髓貼壁培養(yǎng)法提取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2.引物設(shè)計(jì)與合成
　　引物設(shè)計(jì)與合成由大連寶生物公司協(xié)助完成。
　　3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成脂誘導(dǎo)分化
　　細(xì)胞接

13、種于60mm培養(yǎng)皿中48小時(shí)，然后加入含200μM吲哚美辛，1μM地塞米松，0.5mM IBMX,和0.5μg/ml胰島素的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每周更換兩次培養(yǎng)基。正常骨髓干細(xì)胞為對(duì)照組。
　　4. Real-time PCR測(cè)定Evi1基因的表達(dá)
　　在加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后連續(xù)10天中每日提取細(xì)胞總RNA，按照說(shuō)明書(shū)將提取的RNA在一定的化學(xué)反應(yīng)體系以及反轉(zhuǎn)錄條件下合成cDNA,加入到1μl cDNA與上游引物、下游引物、

14、水及SYBR? Premix Ex Taq在CFX96?Real-Time PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，記錄Ct值、擴(kuò)增曲線以及溶解曲線。并相對(duì)定量計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果（2-ΔΔCT法）。
　　5. Western blotting測(cè)定Evi1基因的蛋白含量
　　在加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后連續(xù)10天中每日提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制10%SDS-PAGE凝膠，上樣（上樣量均為25μg/孔）、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、經(jīng)過(guò)一抗、二抗反反應(yīng)后，

15、進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，利用Image J軟件進(jìn)行條帶分析。用目的蛋白的灰度值除去內(nèi)參β-actin的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表樣品的目的蛋白的相對(duì)含量。
　　結(jié)果：
　　與正常培養(yǎng)的骨髓干細(xì)胞相比，Evi1基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化前五天存在一過(guò)性高表達(dá)，并在第三天達(dá)到高峰。
　　結(jié)論：
　　通過(guò)成熟的骨髓干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)方法成功誘導(dǎo)干細(xì)胞的成脂分化，并在這一過(guò)程中運(yùn)用Real-time PCR和Western

16、 blotting分別從Evi1基因mRNA和蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證了本本實(shí)驗(yàn)的第一個(gè)假設(shè)。為下一步實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分腺病毒載體構(gòu)建以及Evi1基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分中的作用
　　目的：
　　以腺病毒為載體，體外構(gòu)建Evi1基因的干擾質(zhì)粒，對(duì)骨髓干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染并檢測(cè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染后對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨分化的影響。為基因治療骨質(zhì)疏松探索新的藥物靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.

17、干擾序列的設(shè)計(jì)與合成
　　大鼠Evi1的mRNA序列（Gene Accession No.：NM_001106423.1），分別針對(duì)第149和1423位點(diǎn)為起點(diǎn)人工合成2條siRNA序列，綠色熒光蛋白序列作為陰性對(duì)照。
　　2.重組腺病毒的構(gòu)建與包裝
　　選擇限制性?xún)?nèi)切酶（BgL2和HindIII）將上述目的片斷定向克隆入穿梭載體pAd-Track-U6；挑取較小的克隆，接種到含卡那霉素的5ml LB液體培養(yǎng)基中，25

18、0轉(zhuǎn)/分鐘，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒；提取的穿梭質(zhì)粒用PmeI對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行線性化，通常酶切過(guò)夜；電轉(zhuǎn)化重組，取線性化的穿梭載體與腺病毒骨架載體充分混合，然后加入到電轉(zhuǎn)杯中，放入電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化；挑取較小的單克隆，10到15個(gè)，接種到含卡那霉素的5ml液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜；提取質(zhì)粒，選取3到4個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行酶切，用PacI進(jìn)行酶切，然后電泳檢測(cè)篩選陽(yáng)性質(zhì)粒；將鑒定正確的質(zhì)粒按照Lipofectmine2000轉(zhuǎn)染試劑要求，轉(zhuǎn)染293A

19、細(xì)胞，收集細(xì)胞及培養(yǎng)液反復(fù)凍融后2000g離心收集上清；再次感染293A細(xì)胞，重復(fù)這一過(guò)程以增加病毒滴度；濃縮、純化重組腺病毒；透析純化病毒懸液；測(cè)定重組腺病毒的滴度。
　　3.轉(zhuǎn)染BMSCs
　　取生長(zhǎng)良好的傳至第3代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿中等細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合時(shí)，更換無(wú)血清L-DMEM培養(yǎng)基后12小時(shí)加入適量的病毒，6-8小時(shí)后更換為骨髓間充干質(zhì)細(xì)胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，24小時(shí)后在倒置熒光顯微鏡下觀察到大量

20、綠色熒光。
　　4.通過(guò)Real-time PCR測(cè)定干擾效率
　　在成功轉(zhuǎn)染后3天提取RNA，同時(shí)提取正常培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的RNA作為對(duì)照組，按照說(shuō)明書(shū)將提取的RNA在一定的化學(xué)反應(yīng)體系以及反轉(zhuǎn)錄條件下合成cDNA，在Real-time PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，記錄Ct值、擴(kuò)增曲線以及溶解曲線。并相對(duì)定量計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果（2-ΔΔCT）。
　　5. Real-time PCR測(cè)定RNA干擾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影

21、響
　　分別在成功轉(zhuǎn)染后1、3、5和7天提取各組細(xì)胞的RNA，同時(shí)提取正常培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的RNA作為對(duì)照組，按照說(shuō)明書(shū)將各組的RNA在一定的化學(xué)反應(yīng)體系以及反轉(zhuǎn)錄條件下合成cDNA后，在Real-time PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，記錄Ct值、擴(kuò)增曲線以及溶解曲線。并相對(duì)定量計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果（2-ΔΔCT）。
　　6. Western blotting測(cè)定RNA干擾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響
　　分別在成功轉(zhuǎn)染后1

22、、3、5和7天提取各組細(xì)胞的蛋白，BCA測(cè)定蛋白濃度。配制10%SDS-PAGE凝膠，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、經(jīng)過(guò)一抗、二抗反應(yīng)后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，利用Image J軟件進(jìn)行條帶分析。用目的蛋白的灰度值除去內(nèi)參β-actin的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表樣品的目的蛋白的相對(duì)含量。
　　結(jié)果：
　　1.干擾序列的設(shè)計(jì)與合成
　　針對(duì)大鼠Evi1的mRNA序列（Gene Accession No.：NM_001106423

23、.1），人工合成2條siRNA序列，分別對(duì)5’-GGAAGCAACATGGAAACAA-3’位點(diǎn)進(jìn)行干擾的siEvi1-1：正鏈5’-GATCCGGAAGCAACATGGAAACAATTCAAGAGATTGTTTCCATGTTGCTTCCT TTTTTG-3’，反鏈5’-AGCTCAAAAAAGGAAGCAACATGGAAACAATCTCTTGAATTGTTTCCATGTT GCTTCCG-3’；和對(duì)5’-GCAGTGAGGTCTGCC

24、ATAA-3’位點(diǎn)進(jìn)行干擾的siEvi1-2：正鏈5’-GATCCGCAGTGAGGTCTGCCATAATTCAAGAGATTATGGCAGACCTCACTG CTTTTTTG-3’，反鏈5’-AGCTCAAAAAAGCAGTGAGGTCTGCCATAATCTCTTGAATTATGGCAGAC CTCACTGCG-3’。
　　2.腺病毒干擾載體的構(gòu)建與作用
　　實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了異位病毒整合位點(diǎn)的腺病毒干擾載體，而且對(duì)骨髓間充質(zhì)

25、干細(xì)胞感染效率高達(dá)95%，干擾效率分別達(dá)到了90.9%和72.3%。
　　3. RNA干擾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響
　　分別用Real-time PCR和Western blotting對(duì)各組1、3、5和7天的成骨分化的標(biāo)志物BSP、OCN和OPN以及成脂分化的標(biāo)志物PPARγ2和LPL進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：RNA干擾后細(xì)胞成脂分化的標(biāo)志物明顯降低而細(xì)胞成骨分化的標(biāo)志物明顯升高。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建異

26、位病毒整合位點(diǎn)的RNA干擾的腺病毒載體；成功轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并且具有很高的干擾效率。驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)的第二個(gè)假設(shè)，為下一步實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。
　　第四部分 ShEvi1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞緩減大鼠骨質(zhì)疏松的作用
　　目的：
　　建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，在大鼠造模后7天將ShEvi1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注謝的方法移植入骨質(zhì)疏松模型大鼠體內(nèi)，注射后28天通過(guò)比較各組的骨密度(BMD)、I型骨膠原N-末端前肽（

27、PINP）、I型膠原羥基未端肽（β—CTX）、和股骨生物力學(xué)指標(biāo)的變化，初步得出RNAi骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠有效緩解骨質(zhì)疏松進(jìn)程。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　8周健康雌性Sprague Dawley（SD）大鼠40只，體重220-250g，由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。分為四組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　2.建立大鼠脊髓損傷模型
　　骨質(zhì)疏松模型：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5%水合氯醛麻醉（0.6ml/100g,腹腔注射

28、）；然后采用腰椎后側(cè)正中切口，椎旁純性分離肌肉組織，切開(kāi)腹膜，進(jìn)入腹腔。完整摘除雙側(cè)卵巢，給予傷口徹底的止血，逐層進(jìn)行縫合，假手術(shù)組手術(shù)操作同上，僅摘除卵巢周?chē)僭S脂肪組織。
　　3.尾靜脈注射ShEvi1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松
　　在骨質(zhì)疏松模型后7天，通過(guò)尾靜脈注射的方法將ShEvi1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入大鼠骨質(zhì)疏松模型體內(nèi)，對(duì)照組分別注射正常培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和L-DMEM培養(yǎng)基。
　　4

29、. ShEvi1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松的檢測(cè)
　　4.1、血清學(xué)測(cè)定
　　大鼠尾靜脈注射治療后28日，取各組大鼠血液5ml離心后取血清用試劑盒對(duì)成骨標(biāo)志物和破骨標(biāo)示物進(jìn)行檢測(cè)。
　　4.2、骨密度測(cè)定
　　使用雙能光子骨密度儀測(cè)量整個(gè)股骨干的骨密度。
　　4.3、生物力學(xué)測(cè)定
　　取雙側(cè)股骨分別進(jìn)行三點(diǎn)彎試驗(yàn)試驗(yàn)。
　　5.統(tǒng)計(jì)處理
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean± SD

30、）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.骨質(zhì)疏松大鼠模型建立成功
　　本實(shí)驗(yàn)采用切除大鼠雙側(cè)卵巢這一成熟經(jīng)典造模方法，術(shù)后手術(shù)組大鼠較其它組體重增加，術(shù)后切口無(wú)感染，所有大鼠均存活。
　　2.血清學(xué)測(cè)定結(jié)果
　　使用上海科敏生物科技有限公司的elisa試劑盒對(duì)大鼠骨生成指標(biāo)Ⅰ型膠原N端前肽和大鼠骨吸收指

31、標(biāo)β骨膠原交聯(lián)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：各組之間差異明顯，治療組優(yōu)于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異；RNAi組優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.骨密度測(cè)定結(jié)果
　　使用雙能光子骨密度儀測(cè)量股骨的骨密度結(jié)果顯示：兩治療組的骨密度較模型組有明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RNAi組優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組；但均低于正常對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.生物力學(xué)結(jié)果
　　三點(diǎn)彎試驗(yàn)結(jié)果顯示：兩治療組生物力學(xué)測(cè)定值高于骨