SPIO、EGFP和SPIO-GFP雙標(biāo)對(duì)大鼠BMSCs成骨、成脂和成肝分化能力的影響.pdf

1、肝功能衰竭是影響人類健康的常見(jiàn)疾病。肝移植是唯一能根除終末期肝病的有效方法，三年生存率達(dá)70％～80％，但移植技術(shù)、圍手術(shù)期管理要求高，移植后可能發(fā)生并發(fā)癥，術(shù)后必需長(zhǎng)期免疫抑制劑治療，更為不足的是肝源短缺，使肝移植惠及人群有限。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem Cells，BMSCs)是來(lái)源于骨髓的一類具有貼壁生長(zhǎng)特性并具備多向分化潛能和自我更新能力的細(xì)胞，在一定條件下可分化為特定組織類型細(xì)胞

2、，包括肝細(xì)胞，是治療肝衰竭的理想種子細(xì)胞?；铙w狀態(tài)下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)植入體內(nèi)BMSCs的存活、遷移乃至分化是BMSCs移植治療推廣至臨床必須解決的一個(gè)重要問(wèn)題。分子影像學(xué)的發(fā)展使活體監(jiān)測(cè)移植干細(xì)胞的歸巢及功能成為可能。目前用于干細(xì)胞活體示蹤的分子影像學(xué)技術(shù)主要包括光學(xué)成像、磁共振成像和核素顯像，各有優(yōu)缺點(diǎn)，因此，聯(lián)合多種影像可以取長(zhǎng)補(bǔ)短，充分發(fā)揮分子影像學(xué)的作用，目前已取得一定成果。細(xì)胞的活體監(jiān)測(cè)離不開(kāi)細(xì)胞標(biāo)記，超順磁性氧化鐵(superpar

3、amagnetic iron oxide，SPIO)是干細(xì)胞MR顯像的一種常用對(duì)比劑。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因標(biāo)記是光學(xué)成像的常用標(biāo)記基因。細(xì)胞標(biāo)記是否影響干細(xì)胞的多向分化能力特別是向目標(biāo)細(xì)胞分化的能力是再生醫(yī)學(xué)必需關(guān)注的問(wèn)題，目前尚未見(jiàn)系統(tǒng)全面介紹GFP和/或SPIO標(biāo)記對(duì)干細(xì)胞成肝分化能力影響的報(bào)道。 研究目的： 實(shí)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成脂和成肝多向分化誘導(dǎo)。通過(guò)對(duì)SPIO標(biāo)記、增強(qiáng)型GFP標(biāo)記和SPI

4、O/GFP雙標(biāo)記干細(xì)胞進(jìn)行成骨、成脂和成肝分化誘導(dǎo)，比較四種細(xì)胞誘導(dǎo)分化效果，探討SPIO標(biāo)記、增強(qiáng)型GFP標(biāo)記和SPIO/GFP雙標(biāo)記對(duì)于細(xì)胞成骨、成脂和成肝分化能力的影響作用，并為課題組后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。 研究方法： 1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取和鑒定 采用密度梯度離心法和貼壁法獲取大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，采用三代后BMSCs，苔盼藍(lán)染色測(cè)細(xì)胞活力，茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞成骨分化能力；油紅O染色驗(yàn)證

5、細(xì)胞成脂分化能力。 2、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞高效分化成具備一定肝功能的肝細(xì)胞 用Matrigel包被培養(yǎng)皿，以21.5×103/CM2的密度種植BMSCs，在含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子—4、表皮生長(zhǎng)因子、ITS+1、地塞米松、維生素C、胎牛血清等的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每三天換液一次。對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞分別從細(xì)胞形態(tài)、基因水平、生化水平等進(jìn)行鑒定。鑒定方法包括光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)變化，RT—PCR檢測(cè)骨髓干細(xì)

6、胞標(biāo)記(骨髓間質(zhì)細(xì)胞抗原1，BST-1)，肝細(xì)胞早期(M2型丙酮酸激酶，M2-PK；甲胎蛋白，AFP)和晚期標(biāo)記(白蛋白，ALB)基因變化，細(xì)胞免疫化學(xué)染色測(cè)AFP、ALB，放免法測(cè)上清液白蛋白濃度，生化分析測(cè)上清液尿素氮(BUN)濃度，糖原染色測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞糖原合成和儲(chǔ)存功能。 3、SPIO、EGFP和SPIO/GFP雙標(biāo)記對(duì)MSC成骨、成脂和成肝分化能力的影響 用帶EGFP基因的慢病毒感染干細(xì)胞96小時(shí)，病毒感染指數(shù)(m

7、ultiplicity of infection，MOI)為20，熒光顯微鏡觀察干細(xì)胞熒光標(biāo)記率，所得EGFP標(biāo)記細(xì)胞記為GFP—MSC；采用25ug/mL SPIO聯(lián)合0.75ug/mL多聚賴氨酸(PLL)孵育48小時(shí)標(biāo)記BMSCs和GFP—MSC，所得標(biāo)記細(xì)胞分別記為SPIO—MSC和SPIO/GFP—MSC。分別對(duì)MSC、GFP—MSC、SPIO—MSC和SPIO/GFP—MSC進(jìn)行成骨、成脂、成肝誘導(dǎo)，比較各指標(biāo)的差異。除成肝分

8、化鑒定采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)誘導(dǎo)兩周時(shí)各組細(xì)胞ALB mRNA表達(dá)量外，其余方法同第1和第2部分。 研究結(jié)果： 1、密度梯度離心法和貼壁法獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性高(大于98％)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)CD29(89.82％)和CD44(70.15％)，不表達(dá)CD45(3.69％)和CD11b(2.93％)。成骨誘導(dǎo)2-3周茜素紅染色見(jiàn)呈橘紅色的鈣鹽沉積；成脂誘導(dǎo)5-9天，油紅O染色顯示誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)紅染的脂滴。

9、 2、成肝誘導(dǎo)后，MSCs增殖減慢，細(xì)胞由長(zhǎng)梭型逐漸向類肝細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，變?yōu)轭悎A形、三角形、多角形。mRNA水平上，誘導(dǎo)細(xì)胞M2-PK、AFP表達(dá)先增加后消失，ALB表達(dá)逐漸增高，誘導(dǎo)28天BST-1無(wú)表達(dá)：免疫細(xì)胞細(xì)胞化學(xué)鑒定：誘導(dǎo)5天、8天細(xì)胞AFP染色陽(yáng)性；誘導(dǎo)14天ALB蛋白染色陽(yáng)性，隨時(shí)間延長(zhǎng)陽(yáng)性率增加；誘導(dǎo)1周起上清液可檢測(cè)到BUN和ALB，并有時(shí)間依耐性；誘導(dǎo)三周細(xì)胞糖原染色即見(jiàn)整個(gè)視野呈陽(yáng)性，四周顏色加深。 3

10、、帶EGFP基因的慢病毒感染MSC標(biāo)記率達(dá)98％.普魯士藍(lán)染色顯示25ug/mL SPIO聯(lián)合0.75ug/mL多聚賴氨酸(PLL)孵育48小時(shí)對(duì)MSC和GFP—MSC標(biāo)記率可達(dá)100％，三種標(biāo)記細(xì)胞活力大于98％；對(duì)SPIO—MSC，GFP—MSC，SPIO/GFP—MSC和MSC四種細(xì)胞成骨誘導(dǎo)3周后茜素紅染色陽(yáng)性，成脂誘導(dǎo)5-9天后油紅O染色陽(yáng)性；對(duì)SPIO—MSC，GFP—MSC，SPIO/GFP—MSC和MSC四種細(xì)胞進(jìn)行成肝

11、誘導(dǎo)，細(xì)胞增殖速度減慢，形態(tài)學(xué)變化相似，誘導(dǎo)兩周時(shí)實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示ALB mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，誘導(dǎo)8天AFP、誘導(dǎo)14天ALB免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果均見(jiàn)大片胞漿染色陽(yáng)性表現(xiàn)，上清液白蛋白、BUN濃度均在第7天可檢測(cè)到，隨時(shí)間上升，2周后達(dá)平臺(tái)；誘導(dǎo)4周糖原染色均呈大片狀紅染。 結(jié)論： 1、密度梯度離心法和貼壁法是大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離的良好手段，獲取的干細(xì)胞純度和活性高，具備成骨、成脂分化能力。