BMP-2基因修飾BMSCs復(fù)合nHAC-PLA材料體外構(gòu)建組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：用攜帶骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）基因的慢病毒病毒載體轉(zhuǎn)染SD大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，接種于納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸（nHAC/PLA）材料構(gòu)建組織工程骨，體外觀察成骨表達(dá)情況。
　　 方法：體外分離、培養(yǎng)SD大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，傳代培養(yǎng)后分為A、B、C組。A組為BMP-2和eGFP 轉(zhuǎn)染組；B組為空慢病毒病毒載體轉(zhuǎn)染組；C組為未轉(zhuǎn)染組。取攜帶BMP-2和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）的慢病毒 (MOI=

2、25pfu/cell)感染SD大鼠BMSCs。熒光顯微鏡下觀察eGFP的表達(dá),判斷感染效率及細(xì)胞生長(zhǎng)情況。通過(guò)噻唑籃（MTT）和流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活力及對(duì)細(xì)胞周期的影響。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、免疫組化和酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）檢測(cè)BMP-2蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染成功后接種于nHAC/PLA支架,構(gòu)建組織工程骨。堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALP 活性，茜紅素染色檢了解成骨情況；掃描電鏡觀察細(xì)胞

3、在支架材料中的黏附、生長(zhǎng)和合成分泌骨基質(zhì)的情況。
　　 結(jié)果：①經(jīng)密度梯度離心法分離、貼壁篩選、培養(yǎng)所獲的細(xì)胞，經(jīng)鑒定是鼠的BMSCs，并且能大量增殖。②慢病毒感染后BMSCs 形態(tài)特征、細(xì)胞增殖情況及細(xì)胞周期與未轉(zhuǎn)染組相比無(wú)顯著變化。③基因轉(zhuǎn)染后48h，RT-PCR、免疫組化和 ELIASA 都能檢測(cè)到BMP-2基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，而空載體轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組未見(jiàn)其轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，差異均有顯著性意義(P<0.05)。④ BMP-2 轉(zhuǎn)染

4、的BMSCs 具有成骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)特性；轉(zhuǎn)染后的BMSCs的ALP 均較空轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組有顯著增高，差異均有顯著性意義(P<0.05)。⑤ BMP-2基因修飾的BMSCs在nHAC/PLA 支架表面和孔隙內(nèi)黏附、生長(zhǎng)良好，仍可高水平表達(dá)BMP-2蛋白。
　　 結(jié)論：①慢病毒攜帶BMP-2基因可有效感染SD大鼠BMSCs 并使BMP-2 獲得穩(wěn)定大量表達(dá)；② BMP-2基因轉(zhuǎn)染后的BMSCs 向成骨細(xì)胞方向分化加快，并