基因修飾成肌細胞結合可注射溫敏凝膠支架構建組織工程骨的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的:骨缺損修復是骨科臨床實踐中常見難題之一,新興的骨組織工程研究為解決該項難題提供了全新的思路。肌衛(wèi)星細胞(musclesatellitecells,MSCs)是骨骼肌內(nèi)最主要的干細胞成分,MSCs及其體外培養(yǎng)的子細胞---成肌細胞(myoblast)具有中胚層譜系內(nèi)的可塑性,尤其具備較強的成骨分化能力。此外,成肌細胞還具有來源豐富、取材容易創(chuàng)傷小及培養(yǎng)方便等優(yōu)勢,且常被用作重要的基因載體,因而成為一種極具應用前景的骨組織工

2、程種子細胞。但成肌細胞應用于骨組織工程尚面臨一些問題:1.對成肌細胞適宜的支架材料研究不多,尤其是對以殼聚糖溫敏凝膠為代表的可注射支架缺乏相應研究;2.成肌細胞體外擴增時其干性(stemness)會迅速丟失,將嚴重影響細胞的成骨分化潛能及移植效率。因此,本實驗的研究目的包括:1.制備一種新型的可注射溫敏凝膠支架---殼聚糖/β-甘油磷酸鈉/膠原(C/GP/Co),觀察它對成肌細胞增殖分化的影響,探討其作為成肌細胞運載支架的可行性;2.在

3、成肌細胞中通過逆轉錄病毒轉染msx1基因(肌節(jié)同源盒基因-1),觀察msx1短暫表達對成肌細胞培養(yǎng)過程中“干性”保持的影響;3.通過體外成骨分化誘導實驗和體內(nèi)異位成骨實驗,檢驗經(jīng)msx1基因修飾后成肌細胞的成骨效能。
　　方法:1.分離培養(yǎng)成肌細胞并觀察制備的C/GP/Co凝膠支架對成肌細胞生長分化的影響:(1)采用差速貼壁結合克隆分選法從綠色熒光蛋白(GFP)轉基因小鼠骨骼肌中分離出成肌細胞并通過結蛋白染色、成肌分化、肌球蛋白重

4、鏈染色加以鑒定;(2)以5:1:6體積比將2.0wt％的殼聚糖溶液(C)、50wt%的β-甘油磷酸鈉(GP)及2mg/mL的I型膠原蛋白溶液(Co)配置成C/GP/Co凝膠,通過掃描電鏡觀察其超微結構;(3)制備不同濃度凝膠浸提液進行細胞培養(yǎng),以CCK-8試劑盒測定細胞活力,并以此計算相對增殖率(RGR)評價支架毒性;(4)成肌細胞在二維培養(yǎng)條件下的生長情況通過細胞活力實驗進行觀察,在三維培養(yǎng)條件下的細胞形態(tài)則通過激光共聚焦顯微鏡和掃描

5、電鏡進行觀察;(5)用液態(tài)的C/GP/Co復合物包裹成肌細胞,注射移植到裸鼠背部皮下組織。通過小動物活體熒光成像系統(tǒng)觀察裸鼠體內(nèi)移植物熒光信號的變化情況。4w后處死裸鼠,通過組織學觀察了解成肌細胞在凝膠內(nèi)的存活情況;(6)評價凝膠介質(zhì)對成肌細胞向成肌、成骨、成脂方向分化能力的影響。以常規(guī)膠原包被表面培養(yǎng)的成肌細胞為對照組,C/GP/Co凝膠表面上進行培養(yǎng)的成肌細胞為C/GP/Co組。成肌分化通過融合指數(shù)(FI)和肌管大小進行評價;成骨分

6、化通過堿性磷酸酶(ALP)活性、茜素紅染色進行評價,成脂分化通過油紅O染色進行評價。2.利用逆轉錄病毒載體將msx1轉染到成肌細胞,并評價經(jīng)基因修飾后的成肌細胞后是否能保持“干性”:(1)逆轉錄病毒轉染msx1基因到成肌細胞并采用免疫印跡實驗(WB)予以鑒定;(2)比較經(jīng)msx1基因修飾(實驗組)和未經(jīng)該基因修飾的成肌細胞(對照組)在細胞形態(tài)、衰老細胞比例、增殖能力、分化相關標記分子表達、遷移能力等指標上的差異。細胞形態(tài)通過透射電鏡(T

7、EM)進行觀察,衰老細胞比例通過β-半乳糖苷酶染色實驗獲取相關數(shù)據(jù),增殖能力通過細胞增殖實驗、增殖指數(shù)(PI)、Ki67指數(shù)及集落形成率進行評價,分化相關標記包括myoD(成肌分化因子)、Pax-7(配對盒轉錄因子-7)和SSEA-1(階段特異性胚胎抗原-1),遷移能力通過Transwell實驗進行評價;(3)比較同代實驗組與對照組成肌細胞在scid/mdx小鼠模型中的移植效率以及不同代次的實驗組細胞在該模型中的移植效率;3.評價經(jīng)ms

8、x1基因修飾后成肌細胞的成骨效能:(1)通過成骨誘導分化實驗比較實驗組與對照組成肌細胞堿性磷酸酶(ALP)活性、鈣鹽沉積面積及成骨分化相關基因表達水平;(2)將成肌細胞與C/GP/Co凝膠復合構建可注射組織工程復合物,在裸鼠體內(nèi)進行異位成骨實驗,通過大體觀察、骨密度檢測、組織切片H&E染色以及骨鈣素免疫組織化學染色等方法比較對照組與實驗組成骨質(zhì)量。
　　結果:1.從小鼠骨骼肌內(nèi)分離出帶有GFP標記的成肌細胞并進行培養(yǎng)、傳代;成功地

9、制備了C/GP/Co凝膠支架并觀察了該材料的超微結構;該支架材料無毒,并且對成肌細胞具有良好的生物相容性,對成肌細胞體外擴增期間多向分化能力的保持具有促進作用:(1)培養(yǎng)的成肌細胞結蛋白染色陽性,成肌誘導條件下能形成肌管,肌球蛋白重鏈染色陽性;(2)制備的C/GP/Co復合物在37℃時約10min內(nèi)由液體形成水凝膠,掃描電鏡下該凝膠為蜂窩狀均質(zhì)多孔結構;(3)浸提液培養(yǎng)實驗中支架毒性分級為0到1級,說明該材料無毒;(4)成肌細胞在凝膠二

10、維及三維培養(yǎng)時均生長良好;(5)凝膠攜帶成肌細胞移植到裸鼠皮下4w后仍可觀察到綠色熒光,組織學檢查發(fā)現(xiàn)支架上有大量成肌細胞存活;(6)凝膠介質(zhì)對成肌細胞的成肌、成骨及成脂分化均有增強作用。在成肌分化實驗中,C/GP/Co組細胞分化后的融合指數(shù)及肌管大小均顯著增加(p<0.05);在成骨分化實驗中,C/GP/Co組細胞在各檢測時相點的ALP活性均顯著增強(p<0.05),在分化21d時的礦化面積百分比也顯著增加(p<0.05);在成脂分化

11、實驗中,C/GP/Co組細胞內(nèi)油紅O染色陽性區(qū)域面積顯著增加(p<0.05)。2.Msx1轉染成肌細胞后能有助于細胞保持“干性”:(1)逆轉錄病毒成功轉染成肌細胞并使后者異位表達msx1蛋白;(2)實驗組成肌細胞較對照組成肌細胞相比:在TEM鏡下具有更小而圓的外型及更年輕化的超微結構;衰老細胞百分比顯著降低(p<0.05);具有更高的增殖指數(shù)(p<0.05)、Ki67指數(shù)(p<0.05)及集落形成率(p<0.05);在免疫熒光陽性率和平

12、均光密度值兩項評價指標中,SSEA-1和Pax-7表達水平均上調(diào)而myoD表達水平下調(diào)(p<0.05);Transwell實驗中表現(xiàn)出更強的遷移能力(p<0.05),且該能力與SDF-1/CXCR4(基質(zhì)細胞衍生因子-1/細胞表面趨化因子受體4)軸有關;(3)移植到scid/mdx小鼠模型后實驗組細胞存活率更高,隨時間推移有更多細胞在宿主體內(nèi)增殖并分化融合并表達肌營養(yǎng)不良蛋白(p<0.05),并且這種高移植效率在細胞培養(yǎng)傳代過程中能有效

13、保持。3.實驗組成肌細胞與對照組相比具有更高的成骨效能:(1)體外成骨誘導實驗中,各檢測時相點實驗組的ALP活性、礦化面積百分比均顯著高于對照組,成骨相關基因的表達水平也顯著高于對照組(p<0.05);(2)異位成骨實驗中實驗組可注射組織工程復合物:大體觀察中形成的骨樣組織體積及硬度更大,骨密度(p<0.05)、新生骨小梁面積百分比(p<0.05)以及骨鈣素染色陽性區(qū)域面積均顯著高于對照組。
　　結論:1.C/GP/Co是一種可注