利用E7多肽修飾的聚己內(nèi)酯-納米羥基磷灰石支架構(gòu)建組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、組織工程技術(shù)的出現(xiàn)，解決了骨缺損傳統(tǒng)治療方式所存在的不足。組織工程支架的研究是組織工程與再生醫(yī)學(xué)研究的重要組成部分。聚己內(nèi)酯(Polycaprolactone，PCL)與納米羥基磷灰石(Nano-hydroxyapatite，nHA)均具有良好的生物相容性和力學(xué)性能，PCL由于其本身性質(zhì)的原因，對(duì)細(xì)胞的親和力不夠。研究發(fā)現(xiàn)，一種氨基酸排列順序?yàn)镋PLQLKM的多肽序列(E7)能夠特異性的吸引人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human Bone Me

2、senchymal Stem Cells，hBMSCs)。希望能用其對(duì)PCL/nHA支架表面進(jìn)行修飾，為組織工程骨的構(gòu)建提供一種新的支架材料。
　　目的：1、借助3D打印技術(shù)制備多孔PCL/nHA支架，并研究其力學(xué)性質(zhì);使用E7多肽對(duì)PCL/nHA支架進(jìn)行修飾，研究其降解性。2、研究E7-PCL/nHA支架對(duì)hBMSCs的生物學(xué)影響。3、研究E7-PCL/nHA支架復(fù)合hBMSCs體內(nèi)的成骨能力。
　　方法：1、水熱法合成n

3、HA，借助3D打印技術(shù)制備多孔PCL/nHA支架，掃描電鏡下觀察其基本形態(tài)。通過壓縮與彎曲測試，比較nHA不同含量(10％，20％，30％)的PCL/nHA支架生物力學(xué)性能。使用被異硫氰酸熒光素(fluorescein-5-isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的E7多肽修飾PCL/nHA支架，置于熒光顯微鏡下觀察修飾情況。E7-PCL/nHA支架植入大耳白兔皮下，研究其降解情況。2、使用密度梯度離心法獲取hBMSCs，體外培養(yǎng)后

4、進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)，并分別使用茜素紅染色、油紅O染色進(jìn)行鑒定。流式細(xì)胞技術(shù)檢測其表面標(biāo)志物。成骨誘導(dǎo)后檢測細(xì)胞成骨相關(guān)基因的表達(dá)。3、在E7-PCL/nHA支架與PCL/nHA支架上接種hBMSCs，掃描電鏡下觀察細(xì)胞生長情況，激光共聚焦顯微鏡下觀察hBMSCs的空間分布情況，以及hBMSCs在兩種支架上的貼附速度。加入β-磷酸三鈣(β-TCP)、珊瑚羥基磷灰石(CHA)作為對(duì)照，研究hBMSCs在四種支架上的粘附、增殖和成骨基因的表達(dá)

5、情況。4、將hBMSCs與E7-PCL/nHA支架、PCL/nHA支架復(fù)合后，體外成骨誘導(dǎo)2周，植入裸鼠皮下，3個(gè)月后取材，標(biāo)本HE染色后進(jìn)行組織學(xué)觀察，及成骨定量檢測。
　　結(jié)果：1、使用水熱法可成功合成結(jié)構(gòu)規(guī)則的nHA，混入PCL后借助3D打印的模具可成功制成多孔的PCL/nHA支架，孔隙均勻;在生物力學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)中，隨著支架內(nèi)nHA含量的升高，支架的彈性模量等指標(biāo)增大。在熒光顯微鏡下觀察使用FITC-E7修飾的PCL/nHA支

6、架，支架發(fā)出均勻綠色熒光。降解曲線顯示隨時(shí)間的延長，支架緩慢降解。2、使用密度梯度離心法可獲取hBMSCs，hBMSCs能向成骨與成脂方向分化，成骨誘導(dǎo)后成骨相關(guān)基因表達(dá)。3、hBMSCs在E7-PCL/nHA支架與PCL/nHA支架上生長狀態(tài)良好，電鏡下可見大量細(xì)胞基質(zhì);激光共聚焦顯微鏡下觀察hBMSCs在E7-PCL/nHA支架與PCL/nHA支架上的空間分布情況，E7-PCL/nHA+hBMSCs復(fù)合物上的細(xì)胞密度要略大于PCL/

7、nHA+hBMSCs復(fù)合物上的細(xì)胞密度;激光共聚焦顯微鏡下觀察接種hBMSCs3h后的細(xì)胞貼附情況，E7-PCL/nHA上的細(xì)胞貼附速度更快。hBMSCs在β-TCP、CHA、E7-PCL/nHA、PCL/nHA四組支架上的粘附情況，PCL/nHA組要低于其他三組;增殖情況也是如此。而對(duì)于誘導(dǎo)14d后成骨基因的表達(dá)，RUNX2與ALP在四組支架上的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;OCN、OPN在β-TCP組表達(dá)要高于其他三組。4、hBMSCs與E7-

8、PCL/nHA支架、PCL/nHA支架復(fù)合后植入裸鼠皮下可成骨，成功構(gòu)建率分別為80％和70％，成骨面積分析兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：1、借助3D打印技術(shù)，可以成功制備出PCL/nHA多孔支架;PCL/nHA多孔支架的機(jī)械強(qiáng)度隨nHA含量的增加而加大;利用sulfo-SMCC作為交聯(lián)劑可以成功將E7多肽修飾于PCL/nHA多孔支架表面上;E7-PCL/nHA可在生物體內(nèi)被降解，降解速度緩慢。2、通過密度梯度離心法可有效分離出