BDNF基因修飾施萬(wàn)細(xì)胞結(jié)合組織工程技術(shù)治療周圍神經(jīng)損傷的研究.pdf

1、目的:
　　(1)研究體外高純度Wistar乳鼠施萬(wàn)細(xì)胞(SCs)的培養(yǎng)方法;
　　(2)研究SCs與殼聚糖支架的組織相容性;
　　(3)將BDNF基因轉(zhuǎn)染的SCs注入預(yù)制殼聚糖導(dǎo)管,構(gòu)建組織工程人工神經(jīng)橋接 Wistar大鼠10mm坐骨神經(jīng)缺損,研究此人工神經(jīng)橋接體的修復(fù)效果及這些促神經(jīng)再生因素之間的相互作用,為組織工程神經(jīng)的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　(1)取3-5d的Wista

2、r乳鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)、臂叢神經(jīng),用酶消化后組織塊種植法培養(yǎng)SCs。用0.25％的胰蛋白酶常規(guī)消化、2次25分鐘差速貼壁法純化SCs,經(jīng)過(guò)1周培養(yǎng),長(zhǎng)滿瓶底后,加入0.25%的胰蛋白酶常規(guī)消化分瓶傳代，S-100免疫組化染色計(jì)算SCs純度。
　　(2)取上述SCs制成懸液,密度為1×105/ml。24孔培養(yǎng)板2個(gè),分為正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,殼聚糖膜平鋪于孔底。SCs接種到培養(yǎng)板內(nèi),在37℃和5%CO2的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后,培養(yǎng)液中

3、加入DAPI(終濃度50μg/ml)孵育過(guò)夜后液,PBS洗滌培養(yǎng)瓶至少3次,以去除未與細(xì)胞結(jié)合的DAPI。加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。觀察SCs和殼聚糖組織相容性。
　　(3)將1×105/ml BDNF基因轉(zhuǎn)染的SCs接種到殼聚糖導(dǎo)管內(nèi),構(gòu)建組織工程人工神經(jīng)橋接體,橋接SD大鼠10mm坐骨神經(jīng)缺損(A組),研究其修復(fù)效果。另設(shè)空白殼聚糖導(dǎo)管組(B組)、假手術(shù)組(C組)、自體神經(jīng)移植組(D組)作為對(duì)照。在術(shù)后6,12周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的經(jīng)電生理

4、檢測(cè)、組織學(xué)切片,光鏡觀察,評(píng)價(jià)其修復(fù)效果。
　　結(jié)果:
　　(1)用酶消化后組織塊貼壁培養(yǎng)的的方法,SCs“爬出”速度較直接組織貼壁培養(yǎng)方法快,進(jìn)一步純化后做S-100細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定為SCs,純度達(dá)到95%以上。
　　(2)SCs與殼聚糖支架的組織相容性:正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各時(shí)點(diǎn)凋亡細(xì)胞的百分率經(jīng)差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。
　　(3)大體觀察:飼養(yǎng)過(guò)程中無(wú)大鼠死亡,大鼠患肢屈曲攣縮情況及拖曳步態(tài)在

5、6周以后有所改善。12周后大鼠處死,未見(jiàn)導(dǎo)管殘留及橋接段上下神經(jīng)萎縮,周圍有血管增生、粘連現(xiàn)象。
　　(4)電生理檢測(cè):四組NCV相互比較,A組與B組、A組與C組均有顯著性差異(P<0.05),A組與D組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。組織學(xué)觀察組織工程神經(jīng)體內(nèi)長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)目的基因-BDNF和報(bào)告基因-GFP、FLAG。
　　結(jié)論:
　　(1)先用酶消化,后組織塊貼壁培養(yǎng)SCs和差速貼壁綜合運(yùn)用的純化方法所“生產(chǎn)”的S

6、Cs數(shù)量較大,純度較高,且細(xì)胞的理化性質(zhì)及生物學(xué)特性受外界環(huán)境影響較小。同時(shí)又節(jié)約了神經(jīng)組織的材料來(lái)源,避免了反復(fù)多次取材的繁瑣操作過(guò)程,節(jié)省人力和物力,并且保證了實(shí)驗(yàn)所需的SCs盡可能來(lái)源于同一只或同一批動(dòng)物。
　　(2)使用冷凍干燥技術(shù)研制的殼聚糖導(dǎo)管表面光滑,透明狀,質(zhì)地均勻。厚度0.15 mm,與蓋玻片的厚度相仿。實(shí)驗(yàn)表明具有良好生物相容性,SCs可以在其表面生長(zhǎng)增殖?？梢宰鳛樯窠?jīng)橋接管。
　　(3)用殼聚糖制作三維