組織工程活性人工神經(jīng)修復周圍神經(jīng)缺損的研究.pdf

1、周圍神經(jīng)組織損傷后的修復、再生一直是神經(jīng)科學、創(chuàng)傷醫(yī)學、康復醫(yī)學的研究熱點之一。自體神經(jīng)移植修復的方法由于存在來源受限和犧牲供區(qū)感覺功能的問題，不能滿足長段神經(jīng)缺損修復的需要，異體神經(jīng)移植由于存在免疫排斥反應，會影響神經(jīng)的再生，因此必須尋找一種神經(jīng)替代物。 本論文針對豬的神經(jīng)應用去細胞方法，獲得去細胞神經(jīng)支架，將雪旺細胞體外培養(yǎng)并提取細胞內(nèi)的雪旺細胞源性營養(yǎng)因子，植入大鼠體內(nèi)修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損，進行了比較系統(tǒng)的研究，希望能為周

2、圍神經(jīng)組織缺損的修復提供一種可行的途徑。實驗分為以下四個部分： 1.成年SD大鼠雪旺細胞的體外培養(yǎng)：目的：探討從成年SD大鼠坐骨神經(jīng)分離培養(yǎng)獲得大量雪旺細胞的有效手段。方法：構(gòu)建神經(jīng)再生室，利用成年SD大鼠發(fā)生Wallerian變性的坐骨神經(jīng)用消化法進行培養(yǎng)。通過相差顯微鏡活細胞計數(shù)和S-100細胞化學標記相結(jié)合鑒定了雪旺細胞增值和純化程度。結(jié)果：通過上述方法獲得大量雪旺細胞經(jīng)S-100蛋白單抗通過SABC法染色鑒定，雪旺細胞純

3、度可達到97％以上。 2.雪旺細胞源性營養(yǎng)因子的提取及其生物學功能的研究：方法：收集雪旺細胞，用細胞超聲粉碎儀粉碎細胞，離心后收集上清液，進行透析后凍干，再進行凝膠層析將粗提的蛋白溶液經(jīng)SephadexG-100凝膠層析得到兩組洗脫峰，將洗脫峰超濾濃縮凍干，用體外培養(yǎng)的雪旺細胞作為鑒定雪旺細胞源性營養(yǎng)因子活性的模型，用MTT法、流式細胞儀檢測兩組洗脫峰對雪旺細胞活性及生長周期的影響。 3.去細胞異種神經(jīng)支架的制備：為獲取

4、生物相容性良好的去細胞異種神經(jīng)支架。將豬的肋間神經(jīng)經(jīng)低滲、-80℃反復凍融和NaOH裂解等方法制備出去細胞神經(jīng)移植物。結(jié)果本實驗所制備的去細胞神經(jīng)支架結(jié)構(gòu)保存完好，有良好的組織相容性，可能成為自體神經(jīng)移植的替代材料。 4.周圍神經(jīng)缺損的修復：用以上方法構(gòu)建的去細胞組織工程周圍神經(jīng)來橋接SD大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損。實驗組：A組為去細胞人工神經(jīng)支架+雪旺細胞+雪旺細胞源性營養(yǎng)因子；B組為去細胞人工神經(jīng)支架+雪旺細胞。對照組：C組為

5、的去細胞人工神經(jīng)支架；D組為自體神經(jīng)移植。四個月后通過透射電鏡、電生理、HRP逆行示蹤等方法檢測神經(jīng)再生及坐骨神經(jīng)功能恢復情況。發(fā)現(xiàn)各組坐骨神經(jīng)均得到再生，結(jié)果顯示A組修復效果與自體神經(jīng)移植組接近，修復效果最好；單純使用去細胞神經(jīng)支架效果最差。表明復合雪旺細胞及神經(jīng)營養(yǎng)因子的組織工程活性人工神經(jīng)對修復周圍神經(jīng)缺損有較好的療效。 結(jié)論： 1.體外培養(yǎng)的成年SD大鼠雪旺細胞可以通過Ara-c、G-418及控制消化時間等步驟在

6、較短時間可以得到純化并大量增殖。 2.利用超聲粉碎雪旺細胞、凝膠過濾層析的方法，從雪旺細胞中分離出雪旺細胞源性營養(yǎng)因子，包含具有維持損傷后的神經(jīng)元活性，誘導和促進再生軸突生長起重要促進作用的神經(jīng)再生因子。對雪旺細胞的增殖有明顯的促進作用，對細胞周期也有明顯的影響。 3.應用組織工程原理與方法利用雪旺細胞、雪旺細胞源性營養(yǎng)因子和去細胞人工神經(jīng)支架在體外構(gòu)建組織工程周圍神經(jīng)，為目前神經(jīng)組織工程提供新的途徑。 4.利用