以天然神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)為支架構(gòu)建組織工程神經(jīng)修復(fù)周?chē)窠?jīng)缺損.pdf

1、隨著現(xiàn)代社會(huì)的發(fā)展,事故傷害、戰(zhàn)爭(zhēng)、地震、腫瘤手術(shù)等導(dǎo)致神經(jīng)損傷的人數(shù)逐年增加。我國(guó)周?chē)窠?jīng)損傷病例每年新增60～90萬(wàn)例,需要通過(guò)神經(jīng)移植來(lái)修復(fù)神經(jīng)的病例約為30萬(wàn)～45萬(wàn)例,若治療不當(dāng)造成終身殘疾,導(dǎo)致嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。目前治療周?chē)窠?jīng)損傷的“金標(biāo)準(zhǔn)”是自體神經(jīng)移植,但其受到供區(qū)神經(jīng)來(lái)源不足,繼發(fā)的供區(qū)神經(jīng)功能喪失,以及供區(qū)神經(jīng)結(jié)構(gòu)和尺寸上不匹配等限制。因此,研發(fā)能夠有效代替自體神經(jīng)的移植替代物是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。組織工程的發(fā)

2、展為修復(fù)周?chē)窠?jīng)缺損提供了新的方法。組織工程神經(jīng)由支架材料、種子細(xì)胞及生長(zhǎng)因子三個(gè)要素組成,還應(yīng)具備組成成份和空間結(jié)構(gòu)雙重仿生。神經(jīng)來(lái)源細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)不僅為細(xì)胞提供了支持結(jié)構(gòu)和附著位點(diǎn),而且本身包含許多生物信息,能夠提供細(xì)胞所需的信號(hào),對(duì)細(xì)胞的粘附、遷移、增殖、分化及基因的表達(dá)調(diào)控有重要作用和顯著影響,對(duì)神經(jīng)再生有明顯的引導(dǎo)和促進(jìn)作用。然而,目前商業(yè)化神經(jīng)再生導(dǎo)管材料中,采用的是豬或牛的Ⅰ

3、、Ⅲ型膠原。這些材料只利用了細(xì)胞外基質(zhì)的一部分,如何更好地保留ECM的主要成分并更好的構(gòu)建組織工程神經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。
　　 目的：研究如何更好地構(gòu)建組織工程神經(jīng)并評(píng)價(jià)修復(fù)效果,即制備具有組成成分和結(jié)構(gòu)仿生的天然神經(jīng)ECM組織工程神經(jīng)支架,同時(shí)復(fù)合具有促神經(jīng)生長(zhǎng)、低免疫原性的種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程神經(jīng),評(píng)價(jià)其修復(fù)周?chē)窠?jīng)缺損效果。
　　 方法：⑴采用低滲凍融、機(jī)械粉碎、差速離心法制備神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)。對(duì)其形態(tài)特征,免疫熒光染色

4、觀(guān)察組成成分,接種雪旺細(xì)胞或背根神經(jīng)節(jié)評(píng)價(jià)細(xì)胞外基質(zhì)生物相容性；⑵定向結(jié)晶技術(shù)制備取向性神經(jīng)源性ECM支架；生物力學(xué)測(cè)試儀測(cè)試神經(jīng)源性ECM支架力學(xué)特性；并通過(guò)測(cè)量軸突神經(jīng)距離評(píng)價(jià)修復(fù)周?chē)窠?jīng)缺損短期效果；⑶體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)、脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)和人臍帶Wharton間充質(zhì)干細(xì)胞向雪旺細(xì)胞分化,免疫

5、熒光染色鑒定表型特征；Dead/live染色檢測(cè)生物蛋白膠中BMSCs存活情況及ELISA檢測(cè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；不同數(shù)量的BMSCs生物蛋白膠復(fù)合物對(duì)背根神經(jīng)節(jié)軸突生長(zhǎng)長(zhǎng)度、雪旺細(xì)胞遷移距離和軸突面積指數(shù)進(jìn)行定量評(píng)價(jià)；⑷采用不同方法分別在化學(xué)去細(xì)胞異體神經(jīng)(chemical extracted acellular nerveallograft,CEANA)內(nèi)部和周?chē)砑犹砑宇?lèi)雪旺細(xì)胞,通過(guò)肢體功能評(píng)估和組織學(xué)檢測(cè)的方法評(píng)價(jià)不同添加方法及添加

6、不同細(xì)胞促CEANA神經(jīng)再生的效果。
　　 結(jié)果：①神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)為直徑30～130 nm的納米微絲。Ⅰ型膠原、層粘蛋白、纖連蛋白染色陽(yáng)性；大鼠背根神經(jīng)節(jié)、雪旺細(xì)胞在神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)上生長(zhǎng)良好。②神經(jīng)源性ECM取向支架橫截面呈多孔蜂窩狀結(jié)構(gòu),縱截面孔道呈平行排列的管道結(jié)構(gòu)；ECM取向支架、CEANA破裂強(qiáng)度、極限應(yīng)力、極限應(yīng)變及斷裂功耗同正常神經(jīng)相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),CEANA同正常神經(jīng)相比彈性模量無(wú)差異,而E

7、CM取向支架彈性模量小于CEANA彈性模量(P<0.05),。ECM取向支架修復(fù)周?chē)窠?jīng)缺損軸突生長(zhǎng)長(zhǎng)度小于CEANA(P<0.05)。③向雪旺細(xì)胞方向誘導(dǎo)的大鼠BMSCs、ADSCs和人臍帶Wharton間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)與雪旺細(xì)胞相似；免疫熒光染色p75和GFAP陽(yáng)性。BMSCs生物蛋白膠復(fù)合物同大鼠背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion,DRG)共培養(yǎng)組,軸突生長(zhǎng)長(zhǎng)度、雪旺細(xì)胞遷移距離和軸突面積指數(shù)明顯大于空白對(duì)照組(

8、P<0.05)。④CEANA復(fù)合dADSC、dMSC和SCs均可提高小腿三頭肌收縮力和小腿三頭肌濕重恢復(fù)率。CEANA復(fù)合dADSC、dMSC和SC可使坐骨神經(jīng)有髓纖維數(shù)增多和髓鞘厚度增加。CEANA內(nèi)、外添加MSCs生物蛋白膠復(fù)合物對(duì)周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù),在功能評(píng)價(jià)和組織學(xué)評(píng)價(jià)具有類(lèi)似的結(jié)果。
　　 結(jié)論：⑴制備的神經(jīng)源性ECM保留了天然神經(jīng)基質(zhì)源性成分,具有良好的細(xì)胞相容性；⑵利用定向結(jié)晶技術(shù)制備出神經(jīng)源性ECM取向性支架；神經(jīng)

9、源性ECM取向性支架力學(xué)特性有待進(jìn)一步提高,而去細(xì)胞異體神經(jīng)生物力學(xué)抗拉強(qiáng)度可滿(mǎn)足神經(jīng)移植材料力學(xué)特性要求；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)神經(jīng)源性ECM取向性具有良好的生物相容性,但周?chē)窠?jīng)損傷短期修復(fù)效果低于CEANA；體外培養(yǎng)證實(shí)去細(xì)胞異體神經(jīng)具有組成成份、管孔結(jié)構(gòu)和管壁纖維取向排列的多重仿生,是理想的組織工程神經(jīng)支架；⑶大鼠BMSCs、ADSCs和人臍帶Wharton間充質(zhì)干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化成類(lèi)雪旺細(xì)胞,其形態(tài)和表型特征與雪旺細(xì)胞相似；BMSCs在生