hNT-4基因修飾嗅鞘細胞結合組織工程技術治療周圍神經損傷的研究.pdf

1、目的:
　　1、研究體外高純度 Wistar乳鼠嗅鞘細胞(OECs)的培養(yǎng)方法;
　　2、研究 OECs與殼聚糖支架的組織相容性;
　　3、構建組織工程人工神經橋接 Wistar大鼠10mm臂叢神經缺損,研究此人工神經橋接體的修復效果及這些促神經再生因素之間的相互作用。
　　方法:
　　1、用差速貼壁法和化學抑制劑法進行分離培養(yǎng) OECs:取3-5天的Wistar乳鼠嗅球,兩次差速貼壁分離培養(yǎng),阿糖胞苷抑制

2、成纖維細胞生長，NGFRp75免疫組化染色計算OECs純度;
　　2、觀察嗅鞘細胞與殼聚糖的生物相容性:將傳代培養(yǎng)的嗅鞘細胞分別接種至殼聚糖包被的培養(yǎng)板(實驗組)和未處理的培養(yǎng)板(對照組)上進行培養(yǎng),應用DAPI熒光染色法檢測細胞存活和增殖狀況;
　　3、將制備的組織工程化人工神經移植進行神經缺損修復實驗:以臂叢神經損傷的Wistar大鼠為動物模型,實驗動物隨機分為4組。A組:殼聚糖導管(橋接)+hNT4-OECs組;B組:

3、自體神經移植組;C組:殼聚糖導管(橋接)組;D組:陰性對照組。于術后6、12周,應用電生理檢測、HE染色、免疫熒光染色觀察嗅鞘細胞的存活、表達及周圍神經結構、功能的恢復情況。
　　結果:
　　1、經 NGFRp75免疫組織化學染色鑒定結果表明成功分離、培養(yǎng)OECs,細胞純度達95％以上;
　　2、OECs與殼聚糖支架的組織相容性:正常對照組和實驗組各時點凋亡細胞的百分率經比較差異無顯著性(P>0.05);
　　3

4、、大體觀察:術后動物均出現不同程度的足底潰瘍、患肢屈曲攣縮及拖曳步態(tài),恢復情況以A、B組最好,C組次之,D組最差,6周以后有所改善,12周后大鼠處死,殼聚糖管吸收完全;
　　4、電生理檢測:A組與C組、D組神經傳導速度(NCV)和神經動作電位振幅(AMP)比較均有統計學意義(P<0.05),A組、B組比較無統計學意義(P>0.05);
　　5、組織學觀察:神經損傷后12周的恢復情況明顯優(yōu)于6周,A組、B組神經纖維粗大、排列整

5、齊,包裹較厚髓鞘;C組神經纖維排列稀疏呈波浪形,內可見新生毛細血管及少量膠原纖維;D組神經纖維紊亂分布,膠原組織較多。組織切片顯示在12周時A組神經損傷處仍有GFP熒光表達,表明嗅鞘細胞在人工神經內仍然存活。
　　結論:
　　1、應用差速貼壁加化學抑制劑法可得到數量較大,純度較高的OECs;
　　2、殼聚糖導管具有良好生物相容性,可以作為神經橋接管;
　　3、用殼聚糖制作三維支架,以hNT-4基因轉染的OECs為