分泌型NgR拮抗肽基因修飾嗅鞘細(xì)胞促進(jìn)視神經(jīng)修復(fù)的實驗研究.pdf

1、第一部分新生大鼠嗅鞘細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和純化研究
　　 目的:探討新生大鼠嗅鞘細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和純化方法，為后期的基因修飾嗅鞘細(xì)胞修復(fù)視神經(jīng)損傷研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:取2d 內(nèi)的新生大鼠嗅球組織，在解剖顯微鏡下分離取材，原代培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞，運用差速貼壁法和差速貼壁+阿糖胞苷+細(xì)胞生長刺激因子法兩種方法進(jìn)行純化，在倒置顯微鏡下觀察不同培養(yǎng)時間嗅鞘細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量和NGFRp75抗體免疫熒光結(jié)果，統(tǒng)計嗅鞘細(xì)胞的純度。

2、>　　 結(jié)果：嗅鞘細(xì)胞的純度分別是差速貼壁組平均為60.41％±4.32％，差速貼壁+阿糖胞苷+細(xì)胞生長刺激因子法組平均為84.98％±4.03％。兩組數(shù)據(jù)用t 檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：取材于新生大鼠，顯微鏡下分離腦膜，差速貼壁+阿糖胞苷+細(xì)胞生長刺激因子法純化，都是良好的嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)方法。
　　 第二部分大鼠NEP1-40基因的擴(kuò)增及重組慢病毒載體的構(gòu)建
　　 目的：構(gòu)建攜帶大鼠N

3、EP1-40目的基因的重組慢病毒，并檢測其體外表達(dá)目的基因的能力。
　　 方法：PCR擴(kuò)增出TAT/NEP1-40編碼片段，定向克隆入pLV.Des2d.P/puro載體，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞包裝攜帶NEP1-40目的基因的重組慢病毒，測序證實為TAT/NEP1-40后大量擴(kuò)增，以基因轉(zhuǎn)移單位（GTU）法測定病毒滴度，運用PCR和western blot分別檢測NEP1-40在293FT細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄

4、水平和蛋白水平的基因表達(dá)。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建攜帶大鼠NEP1-40目的基因的重組慢病毒，并證實其在293FT細(xì)胞中可表達(dá)NEP1-40。結(jié)論攜帶大鼠NEP1-40基因的重組慢病毒可在體外表達(dá)其目的基因，為研究NEP1-40在視神經(jīng)損傷恢復(fù)中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　 第三部分慢病毒介導(dǎo)的NEP1-40基因在體外嗅鞘細(xì)胞中的表達(dá)
　　 目的：研究慢病毒介導(dǎo)的NEP1-40基因在體外嗅鞘細(xì)胞中的表達(dá)，并初步觀察轉(zhuǎn)染了

5、NEP1-40基因的嗅鞘細(xì)胞對視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的作用。
　　 方法:用NEP1-40慢病毒載體轉(zhuǎn)染體外原代培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞，應(yīng)用PCR及ELISA檢測NEP1-40基因在嗅鞘細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)，并將轉(zhuǎn)基因嗅鞘細(xì)胞與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察節(jié)細(xì)胞軸突的生長情況。
　　 結(jié)果:NEP1-40慢病毒載體轉(zhuǎn)染體外原代培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞后經(jīng)過PCR和ELISA檢測，在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平證實NEP1-40基因均有表達(dá)，轉(zhuǎn)基因嗅