bFGF基因修飾的MSCs細(xì)胞復(fù)合β-磷酸三鈣修復(fù)骨缺損實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：骨缺損畸形是頜面外科、骨科、整形外科臨床常見病。頜骨缺損的修復(fù)問題一直是口腔頜面外科較難解決的問題，現(xiàn)常規(guī)的修復(fù)方法很多，但各有其優(yōu)缺點(diǎn)。組織工程化骨是利用生物組織工程技術(shù)將種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合，形成具有與自體骨結(jié)構(gòu)功能相似的骨組織，它彌補(bǔ)了多種單一植骨材料的缺陷，結(jié)合了它們各自的優(yōu)點(diǎn)，具有組織相容性好、骨誘導(dǎo)能力強(qiáng)、取材方便、可快速修復(fù)缺損等特性。用組織工程方法構(gòu)建種子細(xì)胞、支架材料和生長因子復(fù)合的生物活性人工骨被認(rèn)為是未來進(jìn)

2、行骨缺損修復(fù)和骨再造最有效的方法之一。通過人堿性成纖維生長因子（basic fibroblant growth factor，Bfgf）轉(zhuǎn)染以增加組織細(xì)胞Bfgf的分泌量，提高Bfgf 蛋白在生物體骨缺損局部組織中的濃度，達(dá)到促進(jìn)骨愈合的目的。但是，如何提高質(zhì)粒對(duì)于靶組織的轉(zhuǎn)染效率、尋求一種高效、簡便的轉(zhuǎn)染手段，如何縮短鑒定轉(zhuǎn)染是否成功的時(shí)間，以及在基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)骨愈合的過程中，一直未得到很好的闡明。
　　 本研究目的包括以下幾個(gè)

3、方面：
　　 1）建立穩(wěn)定的、基因序列正確的、檢測(cè)方便的、和GFP-慢病毒載體，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染293-FT 細(xì)胞的效率及轉(zhuǎn)染后的生物學(xué)活性；
　　 2）獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs），Bfgf-慢病毒載體轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)第3代的犬BMSCs，了解該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的效率及轉(zhuǎn)染后的生物學(xué)活性；3）體內(nèi)觀察對(duì)比Bfgf基因修飾rMSCs 細(xì)胞活性的影響以及誘導(dǎo)異位成骨

4、的情況，為構(gòu)建更優(yōu)化的骨組織工程種子細(xì)胞和組織工程化骨提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：1）Bfgf基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)人Bfgf基因引物，用Trizol 法提取胎盤組織總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）的方法擴(kuò)增Bfgf基因，連接至ViraPowerTM慢病毒載體系統(tǒng)，經(jīng)Xho-Ⅰ、BamH-Ⅰ雙酶切和測(cè)序并與Genebank中序列進(jìn)行比較分析。2）Bfgf基因遺傳修飾的犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的建立：①結(jié)合Per

5、coll分離液密度梯度離心和差速貼壁傳代篩選法相，分離培養(yǎng)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。②在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine 2000的介導(dǎo)下，Bfgf-pLenti6/V5-D-TOPO 表達(dá)質(zhì)粒同包裝質(zhì)粒Plp1、Plp2、包膜質(zhì)粒Plp/VSVG共轉(zhuǎn)染293FT 細(xì)胞株，收集Bfgf-慢病毒上清轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)后第3代的犬BMSCs，Blasticidin 壓力篩選穩(wěn)定表達(dá)株。③設(shè)計(jì)GFp基因引物，以GFP-PMSLV-Plazmid 為模板

6、，采用PCR的方法擴(kuò)增GFp基因，連接至pLenti6/V5-D-TOPO(R)表達(dá)質(zhì)粒，GFP-慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染BMSCs過程同Bfgf-慢病毒。RT-PCR方法檢測(cè)BfgfMrna水平的表達(dá)。④RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中目的基因Mrna表達(dá)情況，Westernblot，細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞胞漿中目的蛋白表達(dá)情況；ELISA檢測(cè)各各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清中目的蛋白的分泌情況。3）Bfgf基因轉(zhuǎn)染的rMSCs 成骨活性的體內(nèi)

7、實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)共分為4 組進(jìn)行：A、對(duì)照組（空白組）；B、β-磷酸三鈣組；C、MSCs 細(xì)胞復(fù)合β-磷酸三鈣組；D、Bfgf基因修飾rMSCs+β-磷酸三鈣組；①在體外分別將rMSCs和Bfgf基因修飾rMSCs 接種于多孔支架材料磷酸三鈣上。②將不同組細(xì)胞/材料復(fù)合物植入犬牙槽骨內(nèi)。③每組分別于植入3 月后取材，石蠟包埋，組織病理學(xué)切片，HE染色分析新骨形成情況；④術(shù)后4、8和12 周進(jìn)行X 光片、4、8 周CT 攝片觀察骨缺損變化、骨

8、皮質(zhì)及β-磷酸三鈣降解情況。
　　 結(jié)果：1）RT-PCR自腦組織Cdna 庫中擴(kuò)增出Bfgf基因；成功將Bfgf基因克隆入真核表達(dá)載體，構(gòu)建了Bfgf-pLenti6/V5-D-TOPO 表達(dá)質(zhì)粒，DNA 測(cè)序證明，所克隆目的基因序列與Genebank 收錄一致。2）Bfgf 真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，經(jīng)抗生素Blasticidin 壓力篩選獲得了具有抗性的細(xì)胞克隆；GFp真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞48

9、 小時(shí)后，倒置熒光顯微鏡下顯示轉(zhuǎn)染后的犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)可見綠色熒光蛋白分布于整個(gè)細(xì)胞，呈胞漿分布。培養(yǎng)第八代，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞依然存活，綠色熒光蛋白持續(xù)表達(dá)；RT-PCR 結(jié)果顯示抗性細(xì)胞克隆中均有大量目的基因bFGFmRNA 轉(zhuǎn)錄，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中目的蛋白表達(dá)陽性，Western blot 結(jié)果顯示胞漿中有目的蛋白的表達(dá)。3）犬牙槽骨缺損異位誘導(dǎo)成骨實(shí)驗(yàn)顯示：基因修飾MSCs 組與單純MSCs 對(duì)照組相比，材料降解和替代的速度明

10、顯提高，有較多的新骨形成；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物牙槽骨骨缺損愈合過程的X 線4 周、8 周、12 周觀察顯示及4、12 周的CT 掃描，Bfgf基因修飾rMSCs+β-磷酸三鈣組骨缺損在骨皮質(zhì)的連續(xù)性、β-磷酸三鈣的降解速度及骨缺損愈合的大小優(yōu)于MSCs 細(xì)胞復(fù)合β-磷酸三鈣組，β-磷酸三鈣組明顯優(yōu)于對(duì)照組，Bfgf 修飾的MSCs 組在各階段均有比其他組更明顯的材料替換速度。
　　 結(jié)論：
　　 1）成功構(gòu)建了攜帶人Bfgf和GFp