OSX基因修飾的骨髓MSCs促進兔下頜骨牽張成骨的實驗研究.pdf

1、[背景與目的]
　　 牽張成骨(distraction osteogenesis,DO)技術(shù)最早源于矯形外科,用來矯正肢體長度缺陷,后來用于治療顱頜面的先天畸形。牽張成骨成功引入口腔頜面外科為常規(guī)技術(shù)難以矯正的骨缺損和畸形提供了新的方法和思路,它的臨床實踐效果不僅突破了傳統(tǒng)外科理論而且解決了許多傳統(tǒng)外科手段所無法解決的臨床難題。
　　 牽張成骨過程中形成新骨的形態(tài)與、結(jié)構(gòu)和大小接近周圍原骨,無需植骨,避免了骨移植術(shù)的各種

2、并發(fā)癥；骨周圍的軟組織,如肌肉、皮膚、神經(jīng)和血管,可同期同步擴張；此外,牽張成骨手術(shù)創(chuàng)傷小。但牽張成骨的某些局限性如治療周期長、牽張過快過長導(dǎo)致新骨形成不良等問題限制了其在臨床上的進一步推廣應(yīng)用。因此,如何促進牽張新骨形成與礦化,從而縮短牽張成骨治療周期正成為眾多學(xué)者關(guān)注的熱點。
　　 目前,許多方法被嘗試用于促進牽張成骨過程中新骨和骨痂形成,縮短DO固定期。這些方法包括應(yīng)用脫礦骨基質(zhì)、無機鹽、低強度超聲、直流電、電磁場刺激、高

3、壓氧、干細胞和細胞因子等。雖然上述方法獲得了一定的效果,但這些手段均未獲得廣泛的臨床應(yīng)用。
　　 很多生長因子和細胞因子已被證實促進體內(nèi)骨再生,研究最多的是骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)家族,在不同動物模型上都表明可以促進牽張間隙異位成骨,其中BMP-2和BMP-7已被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于骨不連的病人。其他誘導(dǎo)骨生長和分化細胞因子,如轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforminggr

4、owth factor-beta1,TGF-β1)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast
　　 growth factor,bFGF)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growthfactor-1,IGF-1)等也對新骨生成有一定促進作用。但這些外源性應(yīng)用的生長因子數(shù)量要遠遠高于生理劑量才能發(fā)揮成骨的作用,可能與其半衰期短和導(dǎo)入途徑有關(guān)。此外,細胞因子超生理劑量的應(yīng)用不僅費用高昂,限制了臨床廣

5、泛的應(yīng)用,而且導(dǎo)致臨近的非骨組織異位成骨。鑒于這些并發(fā)癥,基于生長因子過表達策略的基因治療成為促進成骨的一種新的策略。
　　 以BMP-2、BMP-7和bBGF為目的基因的基因治療已用于實驗動物并成功的促進牽張成骨新骨形成。但是這種使骨生長因子過表達的基因治療策略,對周圍非骨組織的旁分泌導(dǎo)致的復(fù)雜的釋放動力學(xué)和無法調(diào)控的異位成骨阻礙了這一方法在臨床的應(yīng)用。此外,牽張成骨中新骨形成是一個非常復(fù)雜的過程,是多因素、多細胞因子共同參與

6、的過程,而讓多種生長因子同時高表達有一定困難。
　　 因此,我們設(shè)想了從眾多生長因子、細胞因子和動力傳導(dǎo)的中樞和靶向,即轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的水平尋找牽張成骨基因治療的一種新方法,以避免基于骨生長因子基因治療的一些弊端。
　　 轉(zhuǎn)錄因子,包括Runx2,Smads,Dlx-3,Dlx-5,MSX-2,AP-1和Osterix(OSX)都在骨愈合過程中表達,但在這些成骨分化的轉(zhuǎn)錄因子中,Runx2和Osterix是多潛能骨髓基質(zhì)干

7、細胞向成骨細胞分化的必不可少的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子。Runx2屬于runt結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族,在成骨部位高表達,在骨形成中發(fā)揮著重要作用。Runx2過表達在成骨早期能夠促進成骨細胞分化,但可能抑制成骨細胞的晚期分化。OSX是一種具有鋅指基序結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,位于Runx2的下游,OSX的過表達能誘導(dǎo)有成骨潛能的細胞向成骨細胞分化,補充成骨細胞來源,抑制軟骨細胞形成,促進新骨的成熟和礦化,避免了Runx2抑制成骨細胞的晚期分化的問題。而國際上也

8、尚未查見關(guān)于OSX基因治療用于牽張成骨的報道。
　　 因此,在本研究中選擇OSX為目的基因,首先建立兔單側(cè)下頜骨牽張成骨動物模型,構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-OSX,脂質(zhì)體介導(dǎo)下重組質(zhì)粒pEGFP-OSX瞬時轉(zhuǎn)染MSCs,將OSX修飾的MSCs導(dǎo)入到兔下頜牽張間隙中;應(yīng)用影像學(xué)、組織學(xué)、組織形態(tài)計量學(xué)等手段與對照組比較,評價OSX局部基因治療對牽張成骨中新骨的形成和礦化的作用,并檢測BSP體內(nèi)表達情況。本研究結(jié)果將為OSX基因治療策

9、略促進牽張成骨新骨形成和縮短牽張成骨療程提供科學(xué)的實驗依據(jù),為最終的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1.兔單側(cè)下頜骨牽張成骨動物模型的建立:選擇新西蘭大白兔為實驗動物,4～5個月齡,3.0～3.5 kg,雌雄不限。使用改進的內(nèi)置式牽張器,由螺旋牽張桿、導(dǎo)向滑動桿、固定臂、旋轉(zhuǎn)柄以及連結(jié)旋轉(zhuǎn)柄的方向關(guān)節(jié)等組成,每旋轉(zhuǎn)一圈,牽張距離為0.4mm.用戊巴比妥鈉在兔耳緣靜脈注射麻醉后,在下切牙與后牙之間約1公分的區(qū)域內(nèi)

10、選擇截骨部位,骨切開后用4個鈦螺釘固定牽張成骨器。6天的延遲期后,進行牽張,速度為0.8mm/天(上午8:00.,4rm,下午8:0,0.4mm),連續(xù)10天,共牽張延長8mm,牽張結(jié)束后固定牽張器。分別于固定期開始的第2、6周處死一半動物。動物處死后下頜骨標(biāo)本行X線檢查和組織學(xué)HE染色觀察。
　　 2.pEGFP-OSX的構(gòu)建:PCR擴增獲得目的基因,經(jīng)過純化、酶切、酶切產(chǎn)物回收與純化制備目的基因。載體進行酶切消化后將酶切產(chǎn)物

11、回收、純化,使載體線性化。然后將獲得的目的基因連接到載體,制備感受態(tài)、轉(zhuǎn)化,將構(gòu)建的新質(zhì)粒PCR擴增,測序鑒定。
　　 3.兔自體骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)的培養(yǎng)和傳代,采用密度梯度離心法,取生長良好第3代細胞用于基因轉(zhuǎn)染和治療。
　　 4.脂質(zhì)體介導(dǎo)的pEGFP-OSX質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染MSCs和基因治療:取與每只兔相對應(yīng)的第3代骨髓MSCs,消化計數(shù),并傳代至6孔板內(nèi),用以作基因轉(zhuǎn)染。細胞傳代24h后,細胞達到80％融合

12、,此時采用脂質(zhì)體法進行pEGFP-OSX基因轉(zhuǎn)染操作,通過熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染效率來觀察轉(zhuǎn)染后OSX基因的表達。分別用pEGFP-OSX修飾的MSCs(A組,18只),MSCs(B組,18只)和生理鹽水(C組,18只),在牽張結(jié)束后立即對兔牽張間隙多點注射治療。
　　 5.成骨效果檢測:于牽張結(jié)束第2周和第6周隨機處死各9只動物,標(biāo)本獲取后立即行X線檢查,然后檢測牽張區(qū)骨密度。每個標(biāo)本制作不連續(xù)切片16張,10張用以HE染色,在

13、光鏡下觀察并進行形態(tài)計量學(xué)分析;6張用以免疫組織化學(xué)檢測骨涎蛋白(BSP)表達。骨組織形態(tài)計量學(xué)采用圖像分析軟件進行分析。每一標(biāo)本均測量10張不連續(xù)切片,測量結(jié)果的均數(shù),為該標(biāo)本的測量參數(shù)值。測量參數(shù)包括新生骨量和新生骨小梁厚度。
　　 6.統(tǒng)計學(xué)分析:實驗中牽張間隙骨密度、骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。對每一時間點各指標(biāo)的組間差異應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS11.0進行單因素的方差分析。P<0.05差異具有顯著性。

14、>　　 [結(jié)果]
　　 1.活體觀察實驗動物,均耐受手術(shù)及術(shù)后牽張,飲食大小便正常,牽張結(jié)束后存在偏頜現(xiàn)象。大體標(biāo)本發(fā)現(xiàn)牽張側(cè)下頜骨延長。標(biāo)本X線檢查和組織學(xué)觀察證實動物模型牽張間隙成骨良好,下頜骨按照預(yù)定目標(biāo)延長。
　　 2.通過基因重組技術(shù),成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEGFP-OSX,測序分析證實了pEGFP-OSX質(zhì)粒的正確性。
　　 3.應(yīng)用密度梯度離心法成功分離兔骨髓MSCs,脂質(zhì)體介導(dǎo)的pEGFP-OSX

15、瞬時轉(zhuǎn)染骨髓MSCs,熒光顯微鏡下觀察48小時的轉(zhuǎn)染效率為40-45％。
　　 4.X線、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示,OSX基因修飾的自體骨髓MSCs治療組(A組)比MSCs治療組(B組)顯示出更好的成骨和礦化,自體骨髓MSCs治療組也比生理鹽水注射組(C組)表現(xiàn)出更好的骨痂形成。骨密度和組織形態(tài)計量學(xué)檢測后,統(tǒng)計分析結(jié)果與上述一致,A組顯著優(yōu)于B組(P<0.05),B組顯著優(yōu)于C組(P<0.05)。
　　 5.免

16、疫組織化學(xué)檢測表明在牽張結(jié)束第2周時A組中多數(shù)間充質(zhì)細胞、成骨細胞和新生的骨基質(zhì)均有BSP強染色,B組BSP染色較淺,C組染色最淺。
　　 [結(jié)論]
　　 1.內(nèi)置式牽張器能夠滿足兔單側(cè)下頜骨延長的要求,牽張成骨的延遲期成骨與骨折愈合過程類似,但是牽張期和固定期骨再生具有特征性的組織學(xué)變化。
　　 2.本實驗成功建立了穩(wěn)定的兔單側(cè)下頜骨牽張成骨的動物模型,重復(fù)性高,適合大批量動物實驗,為細胞和基因治療提供了良好的

17、實驗平臺。
　　 3.密度梯度離心法所獲MSCs具有很強的體外增值活性,是進行細胞治療和基因治療的理想種子細胞。熒光顯微鏡下觀察,脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)染可以使pEGFP-OSX基因在MSCs中成功表達,但轉(zhuǎn)染效率很低。
　　 4.X線、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)觀察都證實,與單純MSCs及生理鹽水比較,pEGFP-OSX修飾的MSCs可更有效促進兔下頜牽張成骨過程中新骨形成和礦化,提示OSX基因治療是促進下頜骨牽張成骨行之有效的