分泌型TRAIL基因修飾人脂肪干細(xì)胞靶向腦膠質(zhì)瘤治療的研究.pdf

1、研究背景：
　　神經(jīng)膠質(zhì)瘤（glioma）簡(jiǎn)稱膠質(zhì)瘤，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。膠質(zhì)瘤包括多種不同的腫瘤類型，各個(gè)類型的惡性程度也不相同，其中惡性程度最高的當(dāng)屬多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma multiforme，GBM，WHO IV級(jí)）。由于該腫瘤細(xì)胞呈彌漫性或者浸潤性生長(zhǎng)，手術(shù)難以徹底切除所有腫瘤組織，即使術(shù)后配合放療和化療，患者的預(yù)后依然不理想。據(jù)統(tǒng)計(jì)，GBM患者經(jīng)過治療后的平均生存時(shí)間為14.6個(gè)

2、月。因此，如何改善惡性膠質(zhì)瘤患者的生存率及生存質(zhì)量，這一直是醫(yī)學(xué)界面臨的難題。
　　上世紀(jì)90年代初，基因治療的熱潮曾為惡性膠質(zhì)瘤的治療帶來一線曙光，其中以HSV-TK GCV系統(tǒng)為代表的基因治療雖然在動(dòng)物試驗(yàn)中都取得了良好的效果，但是臨床試驗(yàn)都未取得預(yù)期的療效，這可能是由于病毒載體不穩(wěn)定，目的基因不能長(zhǎng)期表達(dá)，自體免疫，靶向性問題和病毒載體無法追蹤浸潤瘤細(xì)胞所致。目前很多研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，人臍帶血干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞等對(duì)

3、腫瘤都有趨化性。這種趨化性與腫瘤分泌的細(xì)胞因子和趨化因子有關(guān)，并且干細(xì)胞能透過破壞的血腦屏障，在腫瘤周圍高濃度聚集。這一特性已經(jīng)在各種體內(nèi)和體外試驗(yàn)中被證實(shí)。這一特性目前認(rèn)為是將以間充質(zhì)干細(xì)胞作為載體的酶/抗腫瘤前藥基因組合靶向治療腫瘤的理想治療策略之一。脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）目前也證明具有靶向腫瘤遷徙能力。
　　在體外實(shí)驗(yàn)中，腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-rel

4、ated apoptosis-inducing ligand，TRAIL)對(duì)膠質(zhì)瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、肝癌等腫瘤都有誘導(dǎo)凋亡的作用。TRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞，如Hela宮頸癌細(xì)胞、A549肺癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞有特異性的殺傷作用。體內(nèi)的初步藥效學(xué)研究表明，TRAIL可顯著地抑制人肝癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)，但對(duì)正常小鼠無毒副作用。荷瘤動(dòng)物應(yīng)用重組的TRAIL蛋白后能夠明顯

5、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至使腫瘤消退，而對(duì)宿主沒有明顯的損害。許多實(shí)驗(yàn)表明，TRAIL與化療藥物相結(jié)合，有較好的抗腫瘤效果。因此TRAIL基因是理想的目標(biāo)基因，具有明確的抑瘤作用，并且具備更深一步研究的前景。
　　目的：將ADSCs靶向腫瘤遷徙和TRAIL選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞相結(jié)合，探索TRAIL修飾ADSCs雙重靶向治療腦膠質(zhì)瘤的可能。
　　方法：1．人腹部皮下脂肪組織中分離培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞ADSC，驗(yàn)證干細(xì)胞的分化潛能。<

6、br>　　2.驗(yàn)證脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose derived stem cells，ADSCs）向腫瘤細(xì)胞遷移的特性。將腺病毒－綠色熒光蛋白（AAV-GFP）標(biāo)記的ADSCs懸液加入與U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察綠色GFP陽性ADSCs的積聚狀態(tài)。體內(nèi)在建立U87MG膠質(zhì)瘤模型一周后，將LacZ標(biāo)記的ADSCs靜脈途徑移植，觀察ADSCs的積聚情況。
　　3.從pROF-sTraIl質(zhì)粒中獲得sTRAIL基因

7、片段，并將其重組于rAAV-GFP載體質(zhì)粒中，生產(chǎn)出高滴度的AAV-CM-sTRAIL病毒顆粒。將其轉(zhuǎn)染ADSCs后，檢測(cè)其表達(dá)情況。
　　4.采用靜脈或瘤床內(nèi)途徑注射sTRAIL修飾的ADSCs，治療裸鼠的U87MG腦膠質(zhì)瘤模型，觀察對(duì)生存期的影響。
　　結(jié)果：1.人腹部皮下脂肪組織中分離出ADSCs，并在體外擴(kuò)增成功，在條件培養(yǎng)基環(huán)境里能分化成成熟的脂肪細(xì)胞，成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)中熒光顯微鏡下可

8、觀察到，GFP陽性ADSCs均聚積于U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆中，在無膠質(zhì)瘤細(xì)胞的區(qū)域未見GFP陽性細(xì)胞。體內(nèi)在U87MG膠質(zhì)瘤裸鼠模型中腦腫瘤內(nèi)的Lacz陽性的ADSCs(117.52±36.13/seetIon)顯著高于對(duì)側(cè)正常腦組織(34.82±7.14/seetIon)和其它器官(心臟:0/seetIon；肺臟:28.54±7.56/seetIon:肝臟:18.63±5.27/seetIon:脾臟:7.67±5.73/seetIo

9、n:腎臟:31.78±12.04/seetIon)(p<0.001)。種植于腫瘤對(duì)側(cè)半球的ADSCs大部分沿著白質(zhì)纖維束向U87膠質(zhì)瘤遷徙。
　　3.高滴度的AAV-CM-sTRAIL病毒顆粒轉(zhuǎn)染ADSCs后，對(duì)其表型和細(xì)胞活性無明顯影響，ADSCs可穩(wěn)定表達(dá)sTRAIL。
　　4.采用靜脈或瘤床內(nèi)途徑注射sTRAIL修飾的ADSCs，發(fā)現(xiàn)兩種方法均能顯著延長(zhǎng)腦膠瘤裸鼠的生存期，其中有36%的ADSCs-sTRAIL治療組苛