HSV-tk、IL-18聯(lián)合修飾骨髓基質(zhì)干細(xì)胞治療腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤作為人類最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，有很高的發(fā)病率和死亡率。約占成人顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的30％-50％。迄今的治療方法都不能從根本上改變這一致命腫瘤的自然轉(zhuǎn)歸，因而新療法的探索成為神經(jīng)外科的熱點(diǎn)課題。近年來(lái)隨著膠質(zhì)瘤分子生物學(xué)與分子遺傳學(xué)的發(fā)展，同時(shí)基因重組、基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)的成熟，腫瘤基因治療成為研究的熱點(diǎn)，自殺基因治療是其中最常采用的方案。 理想的腦腫瘤的基因治療應(yīng)該是應(yīng)用最佳的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)來(lái)轉(zhuǎn)移最佳的治療基因。自殺基因(HSV-

2、tk/GCV)治療腫瘤的體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均取得了驚人的效果，但臨床療效不能令人滿意，究其原因是基因治療的載體無(wú)法在體內(nèi)腫瘤組織中進(jìn)行廣泛分布，從而不能充分發(fā)揮其旁觀者效應(yīng)。 膠質(zhì)瘤患者均表現(xiàn)出了T淋巴細(xì)胞抗腫瘤作用的減弱，并且，由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞缺乏細(xì)胞表面抗原導(dǎo)致的腫瘤抗原呈遞作用的減弱，進(jìn)一步減弱了抗腫瘤免疫?，F(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為，IL-18 可通過(guò)T淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用，并且通過(guò)上調(diào)MHC分子的表達(dá)、促進(jìn)CD4+輔助性T

3、細(xì)胞向Th1型亞單位的分化增強(qiáng)細(xì)胞免疫。 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是具有遷移能力的細(xì)胞，并可穩(wěn)定的表達(dá)外源性轉(zhuǎn)染的某些基因，為膠質(zhì)瘤基因治療提供了新的思路。 本實(shí)驗(yàn)擬用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞為載體，觀察轉(zhuǎn)染自殺基因的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腦膠質(zhì)瘤的治療作用，再引入IL-18，增強(qiáng)抗腫瘤免疫，觀察兩者相結(jié)合的治療效果，為以骨髓基質(zhì)干細(xì)胞為載體進(jìn)行腦膠質(zhì)瘤的基因治療提供理論依據(jù)。以骨髓基質(zhì)干細(xì)胞為載體，HSV-tk與IL-18聯(lián)合治療

4、膠質(zhì)瘤的研究，在國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。 1．骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記的研究 目的：研究骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，并對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，為進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法：將出生2周的SD大鼠脫頸處死，消毒后取雙側(cè)股骨，自中間剪斷后沖出骨髓細(xì)胞，加入含20％胎牛血清的完全培養(yǎng)液于37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，48小時(shí)后半量換液。以后每2-3天半量換液，7-8天傳代一次。培養(yǎng)初期細(xì)胞較混雜，第6代后細(xì)胞形態(tài)為均一的紡錘形

5、細(xì)胞。MTT法繪制生長(zhǎng)曲線。 將培養(yǎng)第6代、已純化的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)后應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs CD31、CD34、 CD45、CD90、CD44、CD71陽(yáng)性率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50％時(shí)加入BrdU(終濃度10μg/ml)，24小時(shí)后取出玻片用PBS洗滌，4％多聚甲醛固定15分鐘后進(jìn)行免疫組化及免疫熒光染色，封片觀察。將BrdU標(biāo)記的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞注入大鼠顱內(nèi)，3周后處死大鼠取

6、腦，于穿刺點(diǎn)位置附近作石蠟切片并進(jìn)行免疫熒光染色。 結(jié)果：在培養(yǎng)初期可見大量懸浮細(xì)胞，48 小時(shí)后可見有散在紡錘形貼壁細(xì)胞，經(jīng)多次半量換液后，未貼壁細(xì)胞逐漸被去除。細(xì)胞初期多以集落形式生長(zhǎng)，第6代后細(xì)胞呈形態(tài)均一的紡錘形，分布均勻。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，可見細(xì)胞呈一種持續(xù)的增殖狀態(tài)，培養(yǎng)2-3天后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。以流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原，結(jié)果顯示為體積均一的細(xì)胞群，CD31、CD34、 CD45的陽(yáng)性率分別為5.67％、4.3

7、1％、4.42％， CD90、CD44、CD71 的陽(yáng)性率分別為97.17％、98.63％、95.86％。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外免疫組化顯示88.75±4.38％的細(xì)胞可被BrdU標(biāo)記。免疫熒光染色可見胞核染色明顯，BrdU標(biāo)記的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞注入體內(nèi)后3周仍可見明顯的．BrdU著色，穿刺點(diǎn)位置可見密集的細(xì)胞。 結(jié)論：通過(guò)骨髓全細(xì)胞培養(yǎng)的方法可獲得高純度的BMSCs，并可在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)；采用BrdU標(biāo)記骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有較高的標(biāo)記陽(yáng)

8、性率，并且標(biāo)記效果穩(wěn)定。 2．骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向腦膠質(zhì)瘤的趨向性及神經(jīng)轉(zhuǎn)化潛能 目的：在于研究骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向腦膠質(zhì)瘤的趨向性，及骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外環(huán)境中、在特定細(xì)胞因子誘導(dǎo)條件下的細(xì)胞轉(zhuǎn)化，以及骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在腦膠質(zhì)瘤環(huán)境中的轉(zhuǎn)化情況。 方法：體外培養(yǎng)6～7代的BMSCs接種到預(yù)置有多聚賴氨酸包被的蓋玻片的培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞達(dá)到70％融合時(shí)，將蓋玻片轉(zhuǎn)移至含10％胎牛血清的Neurobasal培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，加入全反

9、式視黃酸(0.5μmol/L)、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(10ng/mL)。以正常培養(yǎng)的、未加誘導(dǎo)劑的BMSCs作為對(duì)照。4d后，取出蓋玻片，4％多聚甲醛固定30min，用于免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況。 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞趨瘤性研究的體外實(shí)驗(yàn)采用空心柱試驗(yàn)及Transwell試驗(yàn)。培養(yǎng)大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，消化計(jì)數(shù)，制作大鼠腦膠質(zhì)瘤模型。模型建立3天后隨機(jī)抽取20只荷瘤大鼠，在腫瘤對(duì)側(cè)大腦立體定向種植BMSCs(8×

10、10<'4>個(gè)懸于2μLPBS)。移植后15d，4％多聚甲醛自大鼠心臟灌注后，取出腦組織制作病理切片。用于轉(zhuǎn)化研究的腦組織制作冰凍切片。 結(jié)論：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有明顯的向膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的特性，遷移細(xì)胞多聚集于腫瘤邊緣，只有少數(shù)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可達(dá)到腫瘤內(nèi)部；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外特殊誘導(dǎo)環(huán)境中及移植到荷瘤大鼠腦內(nèi)后，可部分轉(zhuǎn)化為神經(jīng)前體細(xì)胞、神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞。 3.轉(zhuǎn)染HSV-tk 的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞治療腦膠質(zhì)瘤的體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)

11、研究 目的：在于探討以骨髓基質(zhì)干細(xì)胞為載體，觀察轉(zhuǎn)染 tk 基因的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腦膠質(zhì)瘤的殺傷作用。 方法：AdCMlV-tk 病毒擴(kuò)增后用于感染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，而后采用RT-PCR方法檢測(cè)BMSCs/tk對(duì)tk基因的轉(zhuǎn)錄。而后進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)、MTT檢測(cè)BMSCs/tk細(xì)胞表面抗原及生長(zhǎng)曲線。Transwell試驗(yàn)檢測(cè)BMSCs/tk 體外趨瘤性；制作大鼠腦膠質(zhì)瘤模型，將BMSCs/tk 移植到腫瘤對(duì)側(cè)腦組織，觀

12、察其體內(nèi)趨瘤性。將BMSCs/tk與 C6 細(xì)胞混合培養(yǎng)，采用不同的效靶比及不同的GCV濃度，用MTT法、TUNEL、AnnexinV檢測(cè)細(xì)胞存活率或凋亡率，觀察BMSCs/tk 的旁觀者效應(yīng)。進(jìn)一步采用體內(nèi)試驗(yàn)，觀察BMSCs/tk的體內(nèi)旁觀者效應(yīng)，觀察荷瘤大鼠在治療后的生存期改變。 結(jié)論：感染AdCMV-tk后， BMSCs可長(zhǎng)時(shí)間的對(duì)tk基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；BMSCs/tk 具有明顯的顱內(nèi)腫瘤趨向性，并保持旺盛的增殖活性；BMS

13、Cs/tk在體外及在腦膠質(zhì)瘤荷瘤大鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)明顯的腫瘤細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)荷瘤大鼠生存期。 4．HSV-tk、IL-18 聯(lián)合修飾骨髓基質(zhì)干細(xì)胞治療腦膠質(zhì)瘤的體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)研究 目的：是采用IL-18 轉(zhuǎn)染BMSCs，觀察BMSCs/IL-18 的抗腦膠質(zhì)瘤效果；進(jìn)一步采用IL-18及tk聯(lián)合修飾BMSCs，觀察BMSCs/IL-18/tk 的體內(nèi)外抗腫瘤效果。 方法：LXSN/IL-18 感染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSC

14、s/IL-18)，篩選出陽(yáng)性克隆后，感染AdCMV/tk病毒(BMSCs/IL-18/tk)，而后采用RT-PCR 方法檢測(cè)BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk對(duì)IL-18 基因、tk基因的轉(zhuǎn)錄。而后進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)、MTT 檢測(cè)BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk：細(xì)胞表面抗原及生長(zhǎng)曲線。Transwell試驗(yàn)檢測(cè)BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk體外趨瘤性；制作大鼠腦膠質(zhì)瘤模型，

15、將BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk移植到腫瘤對(duì)側(cè)腦組織，觀察其體內(nèi)趨瘤性。將BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk與C6細(xì)胞混合培養(yǎng)，采用不同的效靶比及不同的GCV濃度，用MTT法、TUNEL、AnilexinV 檢測(cè)細(xì)胞存活率或凋亡率，觀察BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk的旁觀者效應(yīng)。進(jìn)一步采用體內(nèi)試驗(yàn)，觀察BMSCs/IlL-18、BMSCs/IL-18/tk 的體內(nèi)抗腦膠質(zhì)瘤作

16、用。ELISA 法檢測(cè)BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk 對(duì)淋巴細(xì)胞分泌的影響。免疫組化方法檢測(cè)BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk 治療后腫瘤組織內(nèi)部微血管密度、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞凋亡情況。MRI檢測(cè)治療后的腫瘤體積改變，觀察荷瘤大鼠在治療后的生存期改變。 結(jié)論：轉(zhuǎn)染IL-18后，BMSCs/IL-18可穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄及表達(dá)IL-18基因；感染AdCMV-tk后，BMSCs/IL-18/tk可穩(wěn)定的