基因重組HSV-TK腺相關(guān)病毒聯(lián)合GCV治療膀胱癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計大約75％的病例為淺表性膀胱癌，其中95％為高危淺表性腫瘤。高危淺表性腫瘤術(shù)后若不給予任何藥物治療，其近期復(fù)發(fā)率為60％-90％。手術(shù)、放療、化療構(gòu)成了腫瘤治療的三大模式。這些治療方法基本都著眼于直接殺傷腫瘤細(xì)胞，常難徹底消滅腫瘤細(xì)胞又易傷及正常組織，特別是在治療的同時會傷害在機(jī)體抗腫瘤防御機(jī)制中占重要地位的免疫系統(tǒng)，尤其是影響機(jī)體的細(xì)胞免疫。在現(xiàn)代分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展的推動下，

2、腫瘤的生物學(xué)治療日益受到人們的重視，顯示出良好的應(yīng)用前景，成為腫瘤治療的第四模式?；蛑委熓巧飳W(xué)治療的一個重要組成部分。其發(fā)展已有近三十年的歷史，在腫瘤治療中最具有潛力。據(jù)統(tǒng)計至1996年底，全世界接受基因治療的患者總數(shù)達(dá)2103人，其中惡性腫瘤占68.8％。 眾多學(xué)者關(guān)注的自殺基因治療是利用基因工程技術(shù)將一些病毒或細(xì)菌基因組中前藥轉(zhuǎn)換酶基因(也叫自殺基因)導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞，該基因編碼特殊的酶，可使原先對哺乳動物細(xì)胞無毒性的前藥在

3、腫瘤細(xì)胞中代謝為毒性產(chǎn)物，從而引起這些細(xì)胞的死亡，所以又稱為“病毒導(dǎo)向的酶解前藥療法”或“分子化療”。胸苷激酶(TK)基因治療就是其中之一，且其研究取得了令人矚目的成就。該酶可將核苷類似物(NA)代謝為二磷酸化物，后者在細(xì)胞內(nèi)酶的作用下生成有毒的三磷酸化物而發(fā)揮抗腫瘤作用，同時其能選擇性地使抗病毒藥物環(huán)氧鳥苷(GCV，目前腫瘤TK基因治療中最常用的前藥)磷酸化成為單磷酸化產(chǎn)物，并在細(xì)胞內(nèi)磷酸激酶的作用下形成三磷酸產(chǎn)物，干擾、阻斷DNA的

4、正常合成和細(xì)胞增生。在腫瘤的治療中，單純皰疹病毒．胸苷激酶(HSV-TK)基因被認(rèn)為最有效，也是唯一被批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的自殺基因。其可將GCV轉(zhuǎn)化為三磷酸GCV，后者代替脫氧三磷酸鳥苷酸結(jié)合于DNA鏈，阻止DNA鏈延長，選擇性殺傷處于增殖分裂期的自殺基因細(xì)胞。 介導(dǎo)HSV-TK的真核表達(dá)載體主要有逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovims)、腺病毒(Ad)、腺相關(guān)病毒(AAV)等；也可不經(jīng)載體介導(dǎo)直接將質(zhì)粒裸DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。在已經(jīng)報道的各種

5、涉及HSV-TK基因治療的體內(nèi)外試驗(yàn)中，由于選擇的基因轉(zhuǎn)移方法不同，可使HSV-TK發(fā)揮的作用不盡相同。 本課題借助已被成功包裝為有復(fù)制缺陷的含目的基因HSV-TK的腺相關(guān)病毒顆粒優(yōu)勢，結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)和動物飼養(yǎng)技術(shù)，進(jìn)行殺傷膀胱癌細(xì)胞及裸鼠膀胱癌模型抑癌作用的實(shí)驗(yàn)研究。該項研究旨在為隨后的動物原位模型體內(nèi)試驗(yàn)、含兩個或兩個以上目的基因的腫瘤基因治療實(shí)驗(yàn)等系列研究奠定理論基礎(chǔ)，同時為膀胱癌等腫瘤疾病的治療開拓一個新的研究平臺。

6、 第一部分基因重組HSV-TK腺相關(guān)病毒聯(lián)合GCV治療膀胱癌的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究 目的： 1．通過觀察基因轉(zhuǎn)染T24膀胱腫瘤細(xì)胞的效果，證明含目的基因HSV-TK的腺相關(guān)病毒基因轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞的可行性。 2．利用HSV-TK腺相關(guān)病毒進(jìn)行體外T24膀胱腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究，觀察其對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響、細(xì)胞生長抑制作用和時間-劑量依賴性。 方法： 1、以rAAV-EGFP轉(zhuǎn)染T24膀胱腫瘤細(xì)胞，來確定

7、腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞的最適MOI值。 2、已被成功包裝為有復(fù)制缺陷的含目的基因HSV-TK的腺相關(guān)病毒對T24膀胱腫瘤細(xì)胞的進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染并得到鑒定，來研究其可行性。 3、體外培養(yǎng)膀胱腫瘤細(xì)胞系T24，接種于96孔板，分別加入rAAV-HSV-TK、 rAAV-MCS重組腺相關(guān)病毒顆粒，并加入含不同濃度GCV，以不加GCV的細(xì)胞為對照，做MTT試驗(yàn)，研究rAAV-HSV-TK/GCV系統(tǒng)對T24細(xì)胞殺傷的劑量依賴性。

8、 4、體外培養(yǎng)膀胱腫瘤細(xì)胞系T24，接種于24孔板，加入rAAV-HSV-TK重組腺相關(guān)病毒顆粒，并參照GCV殺傷的劑量依賴性結(jié)果，每2天換含不同濃度GCV的新鮮培養(yǎng)液。從加GCV當(dāng)天起，每天、每濃度做吖啶橙/EB染色計存活細(xì)胞，研究rAAV-HSV-TL/GCV系統(tǒng)對T24細(xì)胞殺傷的時間依賴性。 5、流式細(xì)胞儀判斷T24細(xì)胞的凋亡。 6、用10μg/mLGCV作用于rAAV-HSV-TK組細(xì)胞24、48、72小時

9、后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及DNA含量的變化，觀察所研究rAAV-HSV-TK/GCV系統(tǒng)對T24膀胱腫瘤細(xì)胞周期的影響。 第二部分基因重組HSV-TK腺相關(guān)病毒聯(lián)合GCV治療膀胱癌的動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究 目的：構(gòu)建裸鼠膀胱腫瘤模型，利用HSV-TK腺相關(guān)病毒聯(lián)合GCV進(jìn)行荷瘤裸鼠的實(shí)驗(yàn)研究，分析其抑瘤作用。 方法： 1、T24細(xì)胞懸液接種于裸鼠腋窩皮下，接種細(xì)胞數(shù)為4×10<'6>，SPF條件下飼養(yǎng)。

10、 2、取已成瘤裸鼠15只，隨機(jī)分為3組：空白對照組、rAAV-MCS和 rAAV-HSV-TK組(此組同時每天腹腔注射GCV 3mg/只)，每組5只，測量各組裸鼠移植瘤體積，組間無差異。治療4周后，頸椎脫臼處死荷瘤裸鼠，對移植瘤進(jìn)行常規(guī)HE染色。各組裸鼠，處死后迅速取心、肝、脾、肺、腎組織，常規(guī)HE染色觀察重組腺相關(guān)病毒對各器官是否有影響。 結(jié)論：體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究顯示宿主細(xì)胞可以表達(dá)出目的基因，rAAV-HSV-TK/GCV系統(tǒng)