IL-18基因?qū)6膠質(zhì)瘤細(xì)胞MDR1基因表達(dá)的影響.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是人類(lèi)最常見(jiàn)的腦部腫瘤。目前,惡性膠質(zhì)瘤的常規(guī)治療手段(手術(shù)加放化療)治療困難、遠(yuǎn)期效果差,死亡率高。對(duì)于惡性程度高的膠質(zhì)瘤患者,生存期短、5年生存率小于1％。怎樣改善膠質(zhì)瘤的治療效果,是臨床面對(duì)的一個(gè)難題。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)的研究進(jìn)展,對(duì)于腫瘤的基因治療方面取得了長(zhǎng)足進(jìn)步,為提高惡性膠質(zhì)瘤的治療效果,增加患者的生存率開(kāi)拓了新的思路。
　　 白細(xì)胞介素18(interleukin-18,IL-18)是一

2、個(gè)具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子?？杉せ頣細(xì)胞、NK細(xì)胞,促使其產(chǎn)生INF-γ。研究證實(shí),在T細(xì)胞或NK細(xì)胞存在的情況下,IL-18具有明顯的抗腫瘤作用,而消除T細(xì)胞、NK細(xì)胞或INF-γ作用后,IL-18仍可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究表明,外源性IL-18基因能下調(diào)PCNA、cyclin D1、cyclin B1的表達(dá),上調(diào)p21的表達(dá),從而降低C6細(xì)胞的增殖能力和惡性程度。
　　 MDR1基因表達(dá)產(chǎn)物P-糖蛋白(P-glycopr

3、otein,P-gp),是細(xì)胞膜上的跨膜蛋白,可在膜上形成藥物通道,具有藥泵功能,參與藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過(guò)程,與腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性密切相關(guān)。此外,P-gp可能具有抑制細(xì)胞死亡的作用。因此,P-gp的表達(dá)水平是影響病人術(shù)后化療效果及生存時(shí)間的主要因素之一。本實(shí)驗(yàn)主要研究MDR1基因在C6/IL-18細(xì)胞系中的表達(dá),并探討其對(duì)化療藥物順鉑敏感性的影響。
　　 目的:研究IL-18基因?qū)Υ笫驝6膠質(zhì)瘤細(xì)胞MDR1基

4、因表達(dá)影響。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng):C6和C6/IL-18細(xì)胞,用RPMI1640培養(yǎng)基,內(nèi)含10％胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml。37℃、飽和濕度、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)。
　　 2.MTT法檢測(cè)C6和C6/IL-18細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C6和C6/IL-18細(xì)胞,經(jīng)0.04％EDTA消化后,加入培養(yǎng)液吹打混勻,以1.5×105/ml細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板,每孔

5、加入180μl細(xì)胞懸液。24h后按照實(shí)驗(yàn)分組分別加入經(jīng)生理鹽水稀釋的不同濃度的藥物20μl,每組均做3個(gè)復(fù)孔。藥物與細(xì)胞共同培養(yǎng)24h,每孔加入5mg/ml MTT20μl,繼續(xù)孵育4小時(shí)后,離心棄上清,加入150μl/孔DMSO終止反應(yīng),振蕩儀振蕩10 min。用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值(A值)。計(jì)算細(xì)胞抑制率和順鉑對(duì)兩種細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C

6、6細(xì)胞和C6/IL-18細(xì)胞,加入IC50的CDDP作用24h后,0.04％EDTA消化、離心,用冷PBS洗兩次,70％乙醇固定細(xì)胞24 h。上機(jī)前離心去乙醇,用PBS洗兩次,加100μg/ml
　　 RNnase37℃消化30 min。50μg/ml PI染色30 min。經(jīng)尼龍網(wǎng)過(guò)濾后,用FACSTAR Calibur型流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson,CA,USA)測(cè)定。同時(shí)用不加藥的相應(yīng)細(xì)胞為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)

7、3次。
　　 4.用RT-PCR法檢測(cè)MDR1基因mRNA的表達(dá)情況,以β—actin為內(nèi)參；檢測(cè)兩種細(xì)胞IL-18 mRNA的表達(dá)情況,作為旁證。根據(jù)核苷酸序列用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)MDR1和β-actin引物。然后,采用Trizol法提取C6和C6/IL-18細(xì)胞總RNA,取2μg細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(37℃60 min,95℃5min),取2μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。條件為95℃預(yù)變性10 min,95

8、℃變性40 s,51℃退火40 s,72℃延伸40 s,共30個(gè)循環(huán),72℃再延伸10 min,4℃保存。最后,PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果、照相,用凝膠。蛋白圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果,分別計(jì)算C6和C6/IL-18細(xì)胞條帶的積分光密度與相對(duì)的β-actin條帶積分光密度的比值。實(shí)驗(yàn)重3次。
　　 5.采用Western-Blot法檢測(cè)P-gp表達(dá)情況,以β-actin為內(nèi)參。用質(zhì)膜蛋白抽提試劑盒,提取C6、C6/IL

9、-18細(xì)胞的胞漿蛋白和膜蛋白,用考馬斯亮藍(lán)G250試劑盒檢測(cè)抽提的蛋白濃度。每孔加入100μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,將靶蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜。NC膜在5％脫脂奶粉中封閉1 h,加入小鼠一抗4℃過(guò)夜,然后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠二抗37℃溫育1 h,利用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色反應(yīng),照相并用凝膠-蛋白圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各蛋白條帶的積分光密度值,分別計(jì)算C6和C6/IL-18細(xì)胞條帶與相對(duì)的β—actin條帶積分光

10、密度比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 6.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(x)±s表示,用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件作單因素方差分析(One-Way ANOVA),取P<0.05為有顯著性意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.順鉑作用24h后,C6細(xì)胞160、80、40、20、10、5、2.5、0.5μg/ml順鉑組的細(xì)胞抑制率是54.26±3.08％、52.92±4.18％、49.20±4.34％、41.40±5.19％、32.35±5.34％

11、、20.69±5.40％、14.27±4.77％、9.20±5.32％；C6/IL-18細(xì)胞的相應(yīng)抑制率分別是69.86±3.82％、65.27±3.72％、60.94±3.37％、53.94±4.81％、40.37±4.72％、29.93±4.68％、20.85±5.08％、8.27±4.61％。C6/IL-18細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增加,與C6細(xì)胞同組的細(xì)胞抑制率比較有顯著性差異(P<0.05),C6細(xì)胞和C6/IL-18細(xì)胞順鉑的IC

12、50分別為55.49±11.04μg/ml和29.66±6.34μg/ml,經(jīng)比較具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,數(shù)據(jù)顯示C6和C6/IL-18細(xì)胞的凋亡率分別為2.40±1.43％和8.72±2.16％,在加入IC50順鉑作用后其凋亡率分別10.57±1.93％和22.63±2.85％。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,差異顯著(P<0.05)。表明,IL-18基因本身能引起細(xì)胞凋亡；在加入藥物后導(dǎo)致細(xì)胞凋

13、亡進(jìn)一步增加,提示IL-18基因能夠提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。
　　 3.RT-PCR結(jié)果顯示IL-18 mRNA在C6細(xì)胞中無(wú)表達(dá),而在C6/IL-18細(xì)胞中表達(dá)明顯。C6和C6/IL-18細(xì)胞MDR1 mRNA的光密度比值分別為0.54±0.06和0.11±0.01,經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件做單因素方差分析,C6/IL-18細(xì)胞MDR1 mRNA表達(dá)水平較C6細(xì)胞差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明,IL-18基因能顯著降低

14、細(xì)胞MDR1基因的轉(zhuǎn)錄水平。
　　 4.對(duì)Western-blot結(jié)果進(jìn)行測(cè)量,C6和C6/IL-18細(xì)胞P-糖蛋白的光密度比值分別為0.40±0.04和0.09±0.02,做單因素方差分析,結(jié)果顯示C6/IL-18細(xì)胞P—gp表達(dá)水平較C6細(xì)胞差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。說(shuō)明,IL-18基因能顯著降低細(xì)胞P-gp的表達(dá)水平。
　　 結(jié)論:IL-18基因與順鉑結(jié)合可明顯增加對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用。其作用機(jī)理與