突變型Axin基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系C6中的功能研究.pdf

1、Axin是1997年發(fā)現(xiàn)的小鼠Fused基因的編碼產(chǎn)物，它在胚胎早期通過特異性抑制Wnt通路，而抑制胚胎體軸的形成，故得名Axin（axis inhibition）。Axin是一個支架蛋白，具有多個結(jié)合位點，可以與信號轉(zhuǎn)導途徑中多個成員結(jié)合構(gòu)成復合物，在多條信號轉(zhuǎn)導通路間發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。隨著研究的深入，Axin至少在Wnt，SAPK/JNK，TGF-β以及p53 四種信號通路中發(fā)揮重要作用。其生物學功能涉及胚胎發(fā)育、神經(jīng)元分化、腫瘤形成、

2、細胞凋亡、糖原代謝等方面。特別是近年來，Axin作為腫瘤抑制因子，引起人們廣泛的興趣。已經(jīng)在一些腫瘤中檢測到Axin基因的突變，如肝細胞癌、結(jié)腸癌、髓母細胞瘤等。Axin過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠中出現(xiàn)不同組織器官大量細胞死亡，腺病毒感染野生型Axin基因到腫瘤細胞，可導致腫瘤細胞凋亡。 我們實驗室在人膠質(zhì)瘤組織中檢測到Axin基因第10個外顯子發(fā)生錯義突變，突變率為21.4％，其中DNA位點20801g-a（Genbank AE006

3、463）突變例數(shù)最多。而后，我們又證實野生型Axin基因的表達可抑制膠質(zhì)瘤細胞C6的增殖并誘導其凋亡。膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。原癌基因激活，抑癌基因失活是腫瘤產(chǎn)生、發(fā)展的主要原因，因此，研究抑癌基因Axin的突變是否影響了其抑制C6細胞增殖的功能以及是否與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，將有助于我們進一步探討膠質(zhì)瘤的發(fā)病機理。 目的：研究突變型Axin基因?qū)6細胞增殖能力及細胞周期的影響，以期揭示突變型Axin基因在膠質(zhì)瘤細胞C

4、6中功能是否發(fā)生改變。 方法： （1）用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建鼠突變型Axin基因真核表達載體Pires2-EGFP-MT-Axin； （2）采用MTT比色法、平板集落形成實驗方法及流式細胞儀測定細胞周期，觀察細胞的增殖能力及細胞周期的變化； （3）采用免疫細胞化學方法觀察Ki67、CyclinD1蛋白表達的改變。 結(jié)果： （1）成功構(gòu)建了突變型Axin基因真核表達載體Pires2-EGFP-

5、MT-Axin，并建立了穩(wěn)定表達突變型Axin基因的膠質(zhì)瘤細胞C6細胞株。 （2）通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染突變型Axin基因與轉(zhuǎn)染野生型Axin基因的C6細胞生長速度與轉(zhuǎn)染空載體組相比均顯著降低（P=0.043、P=0.032），野生型與突變型組間無顯著差異（P=0.881）。 （3）流式細胞儀檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)：C6、C6-Vector 、C6-Vector-WT-Axin 和C6-Vector-MT-Axin處于G1期

6、比例分別為：60.9％、65.4％、75％、70.7％，處于S期的細胞比例分別為：27.2％、24.8％、18.9％和18.5％。C6-Vector-WT-Axin 和C6-Vector-MT-Axin細胞均出現(xiàn)G1期被阻滯，S期比率下降。 （4）細胞集落形成實驗結(jié)果表明：C6、C6-Vector、C6-Vector-WT-Axin 和C6-Vector-MT-Axin集落形成率分別為：39％、25％、7％和8％。轉(zhuǎn)染野生型Ax

7、in細胞與轉(zhuǎn)染突變型Axin細胞之間集落形成能力無差別（χ2=0.072，P=0.788）。 （5）Ki67、cyclinD1陽性反應物均定位于細胞核，Ki67在轉(zhuǎn)染野生型Axin與突變型Axin后的陽性表達率均顯著低于轉(zhuǎn)染空載體組（χ2 值分別為40.737、53.592，P<0.01）, 而轉(zhuǎn)染野生型與突變型Axin 細胞間Ki67的表達無差別（χ2=2.918，P>0.01）。cyclinD1在轉(zhuǎn)染野生型與突變型Axin基

8、因的細胞中陽性表達率亦均顯著低于轉(zhuǎn)染空載體組（χ2 值分別為55.730、22.523，P<0.01）, 而轉(zhuǎn)染野生型Axin細胞與突變型Axin 細胞間cyclinD1的表達無差別（χ2=5.703，P>0.01）。 結(jié)論：突變型Axin基因明顯抑制C6細胞的增殖能力，并且轉(zhuǎn)染突變型Axin基因的細胞與轉(zhuǎn)染野生型Axin基因的細胞，在細胞生長與增殖能力方面均顯著降低，兩者未見顯著差別。因此，膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)的DNA位點20801g