人BMP-4基因修飾的組織工程化骨促進(jìn)脊柱融合的研究.pdf

1、脊柱源性下腰痛(lowbackpain)給患者和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，脊柱融合術(shù)至今仍是對經(jīng)保守治療無效的下腰痛患者所采取的一種標(biāo)準(zhǔn)治療方法。近年來因椎間盤退變性疾病、腰椎不穩(wěn)等原因接受脊柱融合手術(shù)的患者逐年增加，而其存在的問題也逐漸引起了人們的重視。為了解決這些問題，人們進(jìn)行了多方面的嘗試，目前研究的重點(diǎn)逐漸集中在通過生物學(xué)方法改進(jìn)骨移植材料方面。 基因治療和組織工程的興起給人們提供了一種全新的思路：將所需要的骨生長因子基因轉(zhuǎn)

2、入細(xì)胞，再復(fù)合生物支架材料構(gòu)建組織工程骨，回植入體內(nèi)成骨部位，靶細(xì)胞持續(xù)、高效表達(dá)生長因子，誘導(dǎo)成骨，進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)脊柱融合的目的。我們希望在相關(guān)研究的基礎(chǔ)上應(yīng)用腺相關(guān)病毒(AAV)載體介導(dǎo)的病毒重組技術(shù)，將克隆的全長人BMP-4基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，使其高效表達(dá)BMP-4，然后將其與生物支架材料——Ⅰ型膠原蛋白復(fù)合，構(gòu)建一種全新的組織工程化骨。將其回植入新西蘭兔脊柱后外側(cè)，觀察成骨及促進(jìn)脊柱融合的情況。為探索基因治療促

3、進(jìn)成骨和脊柱融合提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。 本研究分為兩部分進(jìn)行： 第一部分：基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)部分 目的：建立一種簡單易行的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)培養(yǎng)及重組人骨形成蛋白4基因腺相關(guān)病毒載體(AAV-hBMP4)構(gòu)建的方法；觀察AAV-hBMP4對BMSCs生物學(xué)行為的影響，為骨組織工程尋找理想的病毒載體及種子細(xì)胞。 方法： (1)BMSCs分離、培養(yǎng)及標(biāo)記：采用全骨髓法分離培養(yǎng)BMSCs，誘導(dǎo)培養(yǎng)

4、液誘導(dǎo)細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)化，行細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查、細(xì)胞表面抗原鑒定、堿性磷酸酶(ALP)染色及VonKossa染色評價(jià)細(xì)胞成骨情況；在此基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染AAV-EGFP，初步探討AAV載體對細(xì)胞的影響，觀察細(xì)胞熒光表達(dá)的時(shí)間及強(qiáng)度，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，MTT法描記細(xì)胞生長曲線，觀察腺相關(guān)病毒載體(AAV)對細(xì)胞活性的影響。 (2)重組人骨形成蛋白4基因腺相關(guān)病毒載體(AAV-hBMP4)的構(gòu)建：根據(jù)hBMP4的基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引入EcoRI位點(diǎn)，

5、下游引入SalI位點(diǎn)，以EX-A0242-M01-hBMP4為模板擴(kuò)增目的基因。將hBMP4基因克隆入pUC18中，獲得重組質(zhì)粒pUC18-BMP4。EcoRI+SalI雙酶切pUC18-BMP4及腺相關(guān)病毒通用質(zhì)粒pSNAV，回收酶切片段，T4連接酶16°c過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受肽細(xì)胞，篩選陽性克隆獲得pSNAV-hBMP4，EcoRI+SalI雙酶切鑒定，并行全基因測序。轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，G418篩選培養(yǎng)，獲得抗藥克隆細(xì)胞

6、株。HSV1-rc/△UL2感染，包裝此細(xì)胞株并收獲病毒載體AAV-hBMP4。 (3)AAV-hBMP4對兔BMSCs生物學(xué)行為及成骨活性的影響：根據(jù)AAV-EGFP轉(zhuǎn)染的初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將AAV-hBMP4按MOI值不同設(shè)定4組，分別轉(zhuǎn)染兔BMSCs，觀察病毒量對細(xì)胞形態(tài)的影響。選取影響最小的MOI值，進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)。MTT法描記細(xì)胞生長曲線，觀察AAV對細(xì)胞增殖活性的影響。以AAV-EGFP為參照，行流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)算轉(zhuǎn)染效

7、率。AAV-hBMP4與AAV-EGFP分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)，行ALP染色、VonKossa染色及ALP含量測定，觀察成骨活性。 結(jié)果： (1)BMSCs分離、培養(yǎng)及標(biāo)記：BMSCs擴(kuò)增迅速、形態(tài)良好、純度較高；經(jīng)誘導(dǎo)后呈現(xiàn)明顯的成骨改變；實(shí)驗(yàn)確定AAV以MOI值為1×105時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到90％；AAV轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞熒光持續(xù)高效穩(wěn)定表達(dá)(＞8w)，并可隨細(xì)胞有絲分裂傳至子代，完全可以滿足示蹤標(biāo)記的

8、需要。 (2)AAV-hBMP4構(gòu)建：PCR電泳及酶切鑒定表明pSNAV-hBMP4重組成功，基因測序顯示裝入PSNAV質(zhì)粒中的hBMP4基因正確；DNA點(diǎn)雜交法示AAV-hBMP4病毒的滴度為1.5×1012vg/ml，分泌蛋白濃度約為0.124mg/ml，SDS-PAGEF法示病毒載體的純度在95％以上。 (3)AAV-hBMP4對兔BMSCs生物學(xué)行為及成骨活性的影響：MOI為5×104vg/cell時(shí)，AAV對細(xì)

9、胞形態(tài)影響最小，以此值進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)。AAV轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞增殖活性良好，轉(zhuǎn)染效率為55-65％。AAV-hBMP4轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)典型的成骨改變，ALP染色及VonKossa染色均出現(xiàn)成骨改變，AAV-EGFP組無上述改變。細(xì)胞上清ALP含量測定，實(shí)驗(yàn)組ALP含量明顯增高(t=2.179，p＜0.01)。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)采用的細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)的方法完全可以滿足骨組織工程的需要；AAV長期穩(wěn)定表達(dá)目的基因，是一種理想的組織工

10、程病毒載體；基于基因轉(zhuǎn)染方法高效穩(wěn)定表達(dá)EGFP，可作為種子細(xì)胞良好的示蹤標(biāo)記方法。本實(shí)驗(yàn)獲得的病毒載體滴度高、感染性好，完全可以滿足骨組織工程的需要。AAV-hBMP4轉(zhuǎn)染的BMSCs可望成為組織工程化骨理想的種子細(xì)胞。 第二部分：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分——新西蘭兔脊柱融合實(shí)驗(yàn) 目的： 探討基于轉(zhuǎn)染人BMP4基因構(gòu)建的組織工程化骨促進(jìn)兔脊柱融合的能力，為自體骨尋找理想的移植替代材料。 方法： AAV-hB

11、MP4及AAV-EGFP分別轉(zhuǎn)染BMSCs后復(fù)合Ⅰ型膠原海綿構(gòu)建組織工程化骨。采用新西蘭兔后外側(cè)L5/6脊柱融合模型，自身側(cè)側(cè)對照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，14只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為隨機(jī)2組，每組各7只，組①右側(cè)植入復(fù)合轉(zhuǎn)AAV-BMP4的BMSCs構(gòu)建的組織工程化骨(BMP4組)，左側(cè)植入自體骨對照(自體骨組)。組②右側(cè)植入復(fù)合轉(zhuǎn)AAV-BMP4的BMSCs構(gòu)建的組織工程化骨(BMP4組)。左側(cè)植入復(fù)合轉(zhuǎn)染AAV-EGFP的BMSCs構(gòu)建的組織工程化骨(EG

12、FP組)。融合術(shù)后12w處死動(dòng)物，分別行X線檢查、三維CT檢查、大體標(biāo)本觀察、手法捫診檢查及組織學(xué)檢查評價(jià)成骨及脊柱融合情況。 結(jié)果： 術(shù)后2組各6只新西蘭兔符合標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行評估。術(shù)后12wX線示12只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中植入BMP4側(cè)有11側(cè)達(dá)到骨性愈合(11/12)，自體骨側(cè)有5只達(dá)到骨性融合(5/6)。EGFP組僅有2側(cè)達(dá)到骨性愈合(2/6)。三維CT及捫診檢查均得到相同的結(jié)果。大體標(biāo)本觀察BMP4側(cè)及自體骨側(cè)新生骨增生明顯，