重組人BMP-4-7復(fù)合基因腺病毒轉(zhuǎn)染SD大鼠BMSCs并誘導(dǎo)其向類髓核細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：(1)對(duì)SD大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行體外培養(yǎng)及傳代，觀察BMSCs的生長(zhǎng)特點(diǎn)及生物學(xué)特點(diǎn)。(2)rhBMP-4、rhBMP-7、rhBMP-4/7復(fù)合基因腺病毒的擴(kuò)增及病毒滴度測(cè)定。(3)將rhBMP-4、rhBMP-7、rhBMP-4/7復(fù)合基因以腺病毒為載體轉(zhuǎn)染BMSCs，觀察其表達(dá)。(4)觀察轉(zhuǎn)染對(duì)BMSCs增殖、分化及功能的影響。
　　方法：(1)取4周齡SD大鼠(雌雄不分)股骨、脛骨骨髓行密度梯度離心法

2、分離培養(yǎng)BMSCs，取第3代細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。(2)利用HEK293T細(xì)胞擴(kuò)增已用GFP標(biāo)記的rhBMP-4、rhBMP-7、rhBMP-4/7復(fù)合基因腺病毒并測(cè)定病毒滴度。(3)實(shí)驗(yàn)分成4組：A組：轉(zhuǎn)染rhBMP-4基因腺病毒組；B組：轉(zhuǎn)染rhBMP-7基因腺病毒組；C組：轉(zhuǎn)染rhBMP-4/7復(fù)合基因腺病毒組；D組：空白對(duì)照組。(4)于轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)21d行組織學(xué)及免疫組化學(xué)觀察；于轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)4d、14d、21d行PCR檢測(cè)Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白

3、、蛋白聚糖基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)液相倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞接種之初，培養(yǎng)瓶中細(xì)胞較多，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)可見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，其中有少量呈成纖維細(xì)胞樣外形的貼壁細(xì)胞，以后這些細(xì)胞呈克隆生長(zhǎng)。HE染色后光鏡下觀察，培養(yǎng)的BMSCs呈梭形、多角形，有多個(gè)突起，胞漿淡藍(lán)色，含有較大的顆粒，細(xì)胞核可見數(shù)個(gè)深藍(lán)色的核仁，細(xì)胞分裂相多見。(2)病毒保存液MOI值為50～100。測(cè)得腺病毒滴度為5×106PFU/mL。(3)腺病毒轉(zhuǎn)染BMSC

4、s后24小時(shí)即可見綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)，而后逐漸增加，約6-7天表達(dá)趨于穩(wěn)定。病毒MOI值為100時(shí)感染SD大鼠BMSCs效率較高，且不影響細(xì)胞正常增殖，細(xì)胞較少出現(xiàn)病理現(xiàn)象，細(xì)胞活性無(wú)明顯降低。(4)轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)21d，細(xì)胞球直徑約為1mm。A、B、C組HE染色示細(xì)胞呈軟骨細(xì)胞樣形態(tài)，甲苯胺藍(lán)染色呈陽(yáng)性；D組陰性；轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)21d，A、B、C組Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，但C組染色較A、B組深；D組肉眼基本不可見。PCR檢測(cè)示：Ⅰ型膠

5、原蛋白表達(dá)量隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)A、B、C組均增加，且各組間無(wú)差異性(P>0.05)，Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)在同一培養(yǎng)時(shí)間A組優(yōu)于B組而次于C，培養(yǎng)14d、21d無(wú)差異，蛋白聚糖表達(dá)在同一培養(yǎng)時(shí)間B組優(yōu)于A組而次于C，培養(yǎng)14d、21d無(wú)差異。
　　結(jié)論：rhBMP-4能增加轉(zhuǎn)染后BMSCsⅡ型膠原蛋白的表達(dá)，rhBMP-7能增加轉(zhuǎn)染后BMSCs蛋白聚糖的表達(dá)；rhBMP-4/7復(fù)合基因可能具有協(xié)同作用同時(shí)增加轉(zhuǎn)染后BMSCs蛋白聚糖和Ⅱ型膠