bFGF、BMP-12基因序貫轉(zhuǎn)染兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)其向韌帶樣細(xì)胞功能分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　ACL這種關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶在膝關(guān)節(jié)中扮演著關(guān)鍵的角色，有利于維持膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性、開展正常的活動(dòng)。由于其極差的自愈能力，損傷后只能通過韌帶移植來修復(fù)，雖然修復(fù)方法繁多，但臨床遠(yuǎn)期療效多不理想，對損傷前交叉韌帶的實(shí)驗(yàn)治療主要集中在細(xì)胞的治療上，脂肪干細(xì)胞（ADSCs）具有取材容易、微創(chuàng)、細(xì)胞繁殖快等突出的優(yōu)勢，所以在韌帶工程種子細(xì)胞應(yīng)用方面具有廣闊的市場前景。ADSCs與MSCs均能體現(xiàn)出多向分化的功能，在某個(gè)特定環(huán)境中能夠轉(zhuǎn)化

2、為骨、軟骨、脂肪細(xì)胞及肌腱等。但植入的ADSCs卻不能較好的修復(fù)韌帶受損部位。其中可能的一個(gè)原因是局部未含大量能夠?qū)σ浦布?xì)胞分化產(chǎn)生刺激作用的細(xì)胞因子。通過體外試驗(yàn)研究結(jié)果表明， TGF-β1，bFGF， BMP-12，IGF-1等生長因子具有誘導(dǎo)ADSCs向成纖維細(xì)胞分化的潛力，因此能夠通過從局部添加上述因子誘導(dǎo)ADSCs分化為成纖維細(xì)胞。但通常來說外源性因子發(fā)揮作用的時(shí)間較短、價(jià)格不菲。將上述細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染至ADSCs細(xì)胞內(nèi)，由自分泌

3、的方式產(chǎn)生相應(yīng)因子促進(jìn)ADSCs分化為成纖維細(xì)胞，以ADSCs充當(dāng)種子細(xì)胞修復(fù)組織韌帶，對于前交叉韌帶損傷的治療具有重要意義。
　　本研究采用BMP-12、bFGF基因轉(zhuǎn)染ADSCs介導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，通過聯(lián)合應(yīng)用I型膠原酶消化法、貼壁培養(yǎng)法兩種方法培養(yǎng)ADSCs，我們采用I型膠原酶消化法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合，分離、純化及鑒定脂肪組織內(nèi)含有的干細(xì)胞，初步探討其生物學(xué)特點(diǎn)。由陽離子脂質(zhì)體對基因轉(zhuǎn)染進(jìn)行誘導(dǎo)，將BMP-12、bFGF

4、序貫轉(zhuǎn)染至ADSCs，并對表達(dá)穩(wěn)定的細(xì)胞進(jìn)行篩選，雙基因聯(lián)合誘導(dǎo)ADSCs向成纖維細(xì)胞方向分化，通過蛋白聚糖Aggrecan、COL1a1、COL3a1、Elastin等指標(biāo)測定來判斷是否穩(wěn)定表達(dá)，聯(lián)合應(yīng)用bFGF、BMP-12基因能夠?yàn)橹委烝CL受損提供一定的參考數(shù)據(jù)。
　　研究材料及方法：
　　一、研究動(dòng)物
　　新西蘭大白兔來自于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部
　　二、研究方法
　　1、培養(yǎng)、鑒定、觀察兔AD

5、SCs及其生物學(xué)特性
　?。?）培養(yǎng)ADSCs
　　通過Ⅰ型膠原酶給予消化，采取貼壁培養(yǎng)的形式，對兔脂肪干細(xì)胞進(jìn)行分離及純化，完成體外培養(yǎng)擴(kuò)增。
　?。?）生物學(xué)性狀的觀察
　　MTT法測定第3，6代細(xì)胞的生長曲線。
　?。?）鑒定兔ADSCs
　　a.CD44、CD49d、CD106免疫熒光法測定細(xì)胞免疫表型。
　　b.誘導(dǎo)成骨細(xì)胞:誘導(dǎo)液包括地塞米松10-8mol/L、β-甘油磷酸鈉10mm

6、ol/L、抗壞血酸50μmol/L。
　　2、BMP-12、bFGF雙基因序貫轉(zhuǎn)染ADSCs誘導(dǎo)其分化為成纖維細(xì)胞的動(dòng)物研究
　?。?）擴(kuò)增、純化及鑒定真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1+bFGF+GFP。
　　（2）擴(kuò)增、純化及鑒定真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1+BMP+RFP-12。
　?。?）構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1+bFGF+GFP-ADSCs細(xì)胞株，經(jīng)RT-PCR法、Western blot法測定bFGF的

7、表達(dá)水平。
　?。?）繪制單基因及雙基因轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖曲線。
　?。?）RT-PCR檢測COL1a1、Elastin的表達(dá)。
　?。?）透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
　　3、Ⅰ型膠原支架復(fù)合負(fù)載有BMP-12、bFGF基因的ADSCs建立三維組織工程韌帶組織
　?。?）將細(xì)胞復(fù)合支架進(jìn)制成冰凍切片進(jìn)行HE染色。
　?。?）將原代培養(yǎng)的ADSCs及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染雙基因的ADSCs的細(xì)胞株與Ⅰ型膠原復(fù)合后行掃描

8、電鏡觀察
　?。?）RT-PCR檢測ADSCs及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染雙基因的ADSCs的細(xì)胞株Aggrecan、COL3a1的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、兔脂肪干細(xì)胞分離、培養(yǎng)成功
　?。?）從兔脂肪中分離提取的細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性，能長期體外培養(yǎng)，生長穩(wěn)定，增殖較快，可以作為組織工程的種子細(xì)胞。
　?。?）制作P2代ADSCs的生長曲線圖，結(jié)果表明ADSCs的增殖與細(xì)胞增殖軌跡相符，其表現(xiàn)出較快的增殖速度。
　

9、?。?）免疫熒光檢測顯示細(xì)胞表達(dá)ADSCs表面抗原標(biāo)志CD44, CD49d， CD44免疫熒光染色陰性。誘導(dǎo)組茜素紅、ALP染色結(jié)果為陽性。
　　2、聯(lián)合應(yīng)用BMP-12、bFGF雙基因，成功將ADSCs介導(dǎo)轉(zhuǎn)化為成纖維樣細(xì)胞
　　（1）順利擴(kuò)增及純化真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1+bFGF+GFP。
　?。?）順利擴(kuò)增及純化真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1+RFP+BMP-12。
　?。?）雙基因轉(zhuǎn)染BMP-12、

10、bFGF后細(xì)胞的增殖能力較強(qiáng)。
　?。?）雙基因轉(zhuǎn)染BMP-12、bFGF后細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)COL1a1、Aggrecan、Elastin、COL3a1，并且和單基因組相比，表達(dá)水平更高。
　　（5）雙基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)提示細(xì)胞合成代謝旺盛，細(xì)胞功能活躍。
　　3、Ⅰ型膠原生物支架復(fù)合負(fù)載有BMP-12、bFGF的ADSCs建立三維組織工程韌帶
　?。?）bFGF、BMP-12能夠成功誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞復(fù)合Ⅰ型

11、膠原支架向成纖維細(xì)胞分化。
　?。?）該支架能夠較好符合誘導(dǎo)后的細(xì)胞，細(xì)胞表現(xiàn)為良好的生長狀態(tài)。
　　結(jié)論：
　　1、原代培養(yǎng)得到的ADSCs具有較強(qiáng)的增殖能力，表現(xiàn)出多向分化的功能， ADSCs能夠充當(dāng)細(xì)胞工程中可行、科學(xué)的種子細(xì)胞。
　　2、雙基因BMP-12、bFGF轉(zhuǎn)染能夠成功誘導(dǎo)ADSCs分化為成纖維樣細(xì)胞。
　　3、雙基因BMP-12、bFGF修飾的ADSCs可以穩(wěn)定表達(dá)韌帶樣細(xì)胞標(biāo)記物，如El