BMP-2-bFGF雙基因共轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞的成骨研究.pdf

1、基因治療是維持骨缺損局部生長因子有效治療濃度進(jìn)而提高療效最有希望的一種方法，但是基因工程在骨缺損的治療中存在種子細(xì)胞來源受限制、單一目的基因缺乏協(xié)同性等問題。BMP-2（Bone morphogentic protein-2，骨形態(tài)發(fā)生蛋白）和bFGF（Basic fibroblast growth factor，堿性成纖維細(xì)胞生長因子）基因分別修飾的種子細(xì)胞均能夠有效地在骨組織工程中發(fā)揮作用，且ADSCs(Adipose Derive

2、dStem Cells，脂肪源性基質(zhì)細(xì)胞，脂肪干細(xì)胞)作為種子細(xì)胞具有來源廣泛、含量豐富等優(yōu)點，有重要的研究價值。
　　生長因子的有效濃度對于脂肪存活亦有很大關(guān)系。自體顆粒脂肪是一種良好的組織充填材料，取材方便，無組織排異性，但在進(jìn)行游離移植時存在吸收率高、存活率低等問題。VEGF(Vascular endothelial growth factor，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子)具有良好的促進(jìn)血管形成能力，殼聚糖微囊作為緩釋載體可以穩(wěn)定

3、的釋放攜帶的生長因子并且沒有毒性，易于降解。
　　目的：
　　1)研究殼聚糖納米微囊介導(dǎo)雙基因（BMP-2/bFGF）復(fù)合體轉(zhuǎn)染于ADSCs之后的成骨性能。
　　2)研究多種基因載體介導(dǎo)攜帶熒光基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于ADSCs后的轉(zhuǎn)染率，篩選出能高效表達(dá)目的基因的基因載體。
　　3)研究慢病毒介導(dǎo)雙基因（BMP-2/bFGF）復(fù)合體轉(zhuǎn)染于ADSCs之后的成骨性能。
　　4)觀察VEGF與殼聚糖微囊復(fù)合的緩釋系統(tǒng)對

4、自體脂肪移植成活率的影響。
　　方法：
　　1)采用殼聚糖納米微囊介導(dǎo)雙基因(BMP-2/bFGF)復(fù)合體轉(zhuǎn)染于ADSCs，設(shè)置空白組（殼聚糖）、BMP-2對照組（殼聚糖+BMP-2）、bFGF對照組(殼聚糖+bFGF)、實驗組（殼聚糖+bFGF+BMP-2），對轉(zhuǎn)染率、目的基因的表達(dá)、成骨性能指標(biāo)OCN（骨鈣素）和BSP(骨唾液蛋白)進(jìn)行檢測，并應(yīng)用于裸鼠進(jìn)行股后肌群注射成骨和股骨缺損的修復(fù)實驗研究。
　　2)采用殼

5、聚糖、季銨化殼聚糖、季銨化殼寡糖、X-treme GENE HP DNATransfection Reagent、脂質(zhì)體、慢病毒分別轉(zhuǎn)染攜帶熒光基因的質(zhì)粒于ADSCs，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染率。
　　3)采用慢病毒介導(dǎo)雙基因(BMP-2/bFGF)復(fù)合體轉(zhuǎn)染于ADSCs，設(shè)置空病毒組（慢病毒）、BMP-2對照組（BMP-2-慢病毒）、bFGF對照組（bFGF-慢病毒）、實驗組（bFGF-BMP-2-慢病毒），對轉(zhuǎn)染率、目的基因的表達(dá)

6、、成骨性能指標(biāo)OCN（骨鈣素）和BSP(骨唾液蛋白)進(jìn)行檢測，觀察對細(xì)胞凋亡和增殖的影響，并應(yīng)用于裸鼠進(jìn)行皮下注射成骨和顱骨缺損的修復(fù)實驗研究。
　　4)從人體獲取脂肪，經(jīng)純化，消化后按加入物不同分成4組，即實驗組（脂肪+VEGF殼聚糖微囊）、殼聚糖微囊對照組（脂肪+空殼聚糖微囊）、VEGF組（脂肪+VEGF）、空白組（脂肪）。各混和組中脂肪組織與殼聚糖、生長因子或生長因子復(fù)合緩釋載體的比例均為3∶1。各組混合物分別注射于裸鼠背部

7、皮下。分別在術(shù)后3，6，12周取材，行移植物質(zhì)量、電鏡超微結(jié)構(gòu)、組織學(xué)染色和微血管CD34染色檢測。
　　結(jié)果：
　　1)殼聚糖納米微囊介導(dǎo)的雙基因(BMP-2/bFGF)復(fù)合體轉(zhuǎn)染ADSCs的效率較低，為5％-10％。實驗組的目的基因協(xié)同表達(dá)能力均優(yōu)于對照組和空白組，在成骨指標(biāo)OCN和BSP的表達(dá)上均明顯優(yōu)于對照組和空白組，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.01)。在股后肌群異位成骨和股骨缺損的修復(fù)獲得陰性結(jié)果。
　　2)殼

8、聚糖的轉(zhuǎn)染率為5％-10％，季銨化殼聚糖為1％-5％，季銨化殼寡糖為5％-10％，X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent為15％-20％，脂質(zhì)體為5％-10％，慢病毒為90％-95％。慢病毒的轉(zhuǎn)染效率為最高。
　　3)慢病毒轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90％-95％，介導(dǎo)的實驗組的目的基因協(xié)同表達(dá)能力優(yōu)于對照組和空病毒組，在成骨指標(biāo)OCN和BSP的表達(dá)上均明顯優(yōu)于對照組和空病毒組，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0

9、.01)，實驗組和對照組與空病毒組相比，對細(xì)胞凋亡是有抑制作用的，并且促進(jìn)細(xì)胞的增殖。在皮下異位成骨和顱骨缺損的修復(fù)獲得陰性結(jié)果。
　　4)實驗組（殼聚糖微囊復(fù)合VEGF）的移植物重量和血管密度均高于對照組，具有統(tǒng)計學(xué)意義，其余各對照組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1)殼聚糖納米微囊介導(dǎo)的雙基因(BMP-2/bFGF)轉(zhuǎn)染ADSCs具有良好的目的基因協(xié)同表達(dá)能力和成骨性能。
　　2)慢病毒載體介導(dǎo)的ADS