GAS表面蛋白Fba保護(hù)性區(qū)段的鑒定及其表位的篩選.pdf

1、目的：A族乙型溶血性鏈球菌（GAS）是鏈球菌中致病性最強(qiáng)的一種，可長(zhǎng)期寄居于人體鼻咽部和腸道中，引起各種化膿性炎癥、猩紅熱、丹毒、新生兒敗血癥、腦膜炎、產(chǎn)褥熱以及鏈球菌變態(tài)反應(yīng)性疾病等。臨床上存在著反復(fù)感染和難以治愈等問(wèn)題。如果將菌體表面蛋白作為疫苗，將刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，干擾鏈球菌侵入細(xì)胞，從而易于機(jī)體清除鏈球菌。候選的菌體蛋白中對(duì)M蛋白的了解最清楚，但由于M蛋白血清型太多，且M蛋白可能引起嚴(yán)重的變態(tài)反應(yīng)，使得M蛋白作為疫苗的應(yīng)用受

2、到限制。世界各地不同實(shí)驗(yàn)室的研究涉及到鏈球菌的F1蛋白、C5肽酶、鏈球菌糖、外毒素等，但免疫效果始終難以超越M蛋白。本研究在已知A族鏈球菌表面蛋白Fba具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)性的基礎(chǔ)上，將分段克隆表達(dá)的Fba蛋白免疫動(dòng)物并攻毒，以確定其具有保護(hù)性功能的區(qū)段。制備Fba蛋白的多抗，用純化的抗Fba蛋白的多抗篩選噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)（Ph·D-7），獲得多個(gè)Fba蛋白抗原的線性表位及構(gòu)象表位。
　　 方法：⑴根據(jù)Fba蛋白的結(jié)構(gòu)特

3、點(diǎn)將其劃分為四個(gè)重疊區(qū)域：37～110aa、68～161aa、104～277aa、160～324aa。分別命名為Fba1、Fba2、Fba3、Fba4。大量表達(dá)Fba分段蛋白，親和柱層析純化后免疫動(dòng)物。⑵將雌性Balb/c小鼠分為五組，每組8只，分別為FbaA1蛋白組、FbaA2蛋白組、FbaA3蛋白組、FbaA4蛋白組及PBS對(duì)照組，各組均以相同劑量蛋白免疫小鼠并加強(qiáng)免疫兩次，每次免疫均間隔兩周，并在每次免疫前內(nèi)眥取血，末次免疫后兩周

4、取血。⑶ELISA檢測(cè)各免疫組血清IgG水平。使用致死量的GAS（M+Fba+）攻擊免疫三次后的小鼠，計(jì)算各組的保護(hù)率。⑷將純化的Fba蛋白免疫新西蘭兔，以相同劑量蛋白免疫四次，每次免疫均間隔兩周，末次免疫后兩周頸動(dòng)脈取血處死。ELISA檢測(cè)兔血清IgG水平。純化抗體，ELISA檢測(cè)純化后抗體水平。⑸采用純化的IgG篩選噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)，經(jīng)3輪生物淘洗后，隨機(jī)挑取分隔良好的克隆，通過(guò)夾心ELISA試驗(yàn)檢測(cè)其與多抗的親和力，挑選其中親和力

5、高的21個(gè)噬菌體克隆，提取單鏈DNA并測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果推導(dǎo)出其氨基酸序列，再與Fba蛋白序列進(jìn)行比較分析，推斷Fba蛋白的表位。
　　 結(jié)果：①經(jīng)SDS-PAGE分析顯示成功表達(dá)并純化了Fba分段蛋白。②將純化的Fba分段蛋白免疫動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)組血清IgG產(chǎn)生呈逐漸增高趨勢(shì)，其中以Fba2蛋白組效價(jià)升高最為明顯，達(dá)1：102400，依次為Fba3、Fba4及Fbal蛋白組。③攻毒后5天，PBS組小鼠全部死亡，各實(shí)驗(yàn)組連續(xù)觀察兩周后