漢灘病毒結(jié)構(gòu)蛋白線性B細(xì)胞表位的篩選和鑒定.pdf

1、腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）是由漢坦病毒（hantavirus，HTV）引起的以鼠類為主要傳染源的一種自然疫源性疾病，又稱流行性出血熱（epidemic hemorrhagic fever，EHF），簡(jiǎn)稱出血熱。全球每年新發(fā)病例有90％左右在中國(guó)；死亡率在2%~10%左右。該病在我國(guó)絕大多數(shù)省區(qū)流行，病情危急，危害很大。漢灘病毒（hantaan virus，HTN

2、V）和漢城病毒（Seoul virus，SEOV）是我國(guó)HFRS的兩種主要病原體。
　　漢坦病毒感染可引起機(jī)體明顯的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。體液免疫應(yīng)答強(qiáng)烈而持久；細(xì)胞免疫可能在免疫保護(hù)和免疫病理?yè)p傷兩方面都有作用。漢坦病毒核蛋白是誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答主要的免疫原，可在發(fā)病數(shù)天內(nèi)引起抗體應(yīng)答。因此，重組核蛋白常被用來(lái)檢測(cè)患者血清中病毒特異性抗體的類型和水平，為HFRS的診斷提供依據(jù)。糖蛋白免疫原性較弱，糖蛋白特異性抗體出現(xiàn)稍晚，多在病程中后期

3、。但是，一般認(rèn)為漢坦病毒糖蛋白是誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的主要來(lái)源；而據(jù)報(bào)道，中和抗體出現(xiàn)的早晚與患者的病情及預(yù)后密切相關(guān)。人感染漢坦病毒后，血清病毒特異性IgG水平隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷升高，一般于恢復(fù)早期達(dá)到平臺(tái)期；持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，有時(shí)在病愈后數(shù)十年仍可檢測(cè)到。
　　抗體的產(chǎn)生離不開抗原特異性B細(xì)胞的活化、增殖、分化；抗原特異性B細(xì)胞接觸并結(jié)合抗原是體液免疫應(yīng)答的始動(dòng)環(huán)節(jié)；而這離不開B細(xì)胞受體（B cell receptor，BCR）對(duì)抗原的有效

4、識(shí)別。抗原與BCR相互識(shí)別、發(fā)生作用的結(jié)構(gòu)叫做抗原決定簇（antigenic determinants），又稱表位(epitope)。表位是抗原與抗體發(fā)生作用的主要部位，是抗體識(shí)別抗原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　研究漢坦病毒結(jié)構(gòu)蛋白特異性抗體識(shí)別的B細(xì)胞表位對(duì)于深入認(rèn)識(shí)病毒致病和抗體產(chǎn)生機(jī)制，中和抗體的免疫保護(hù)作用，以及研發(fā)新的診斷材料、亞單位疫苗等具有重要意義。目前，有關(guān)漢灘病毒結(jié)構(gòu)蛋白B細(xì)胞表位的報(bào)道較少，尚缺乏系統(tǒng)的研究。
　　

5、本論文首次采用合成的重疊多肽對(duì)HFRS患者血清抗體識(shí)別的HTNV核蛋白（nucleocapsid protein，NP）線性B細(xì)胞表位進(jìn)行了系統(tǒng)分析。把覆蓋HTNV NP氨基酸全序列的70條重疊15肽包被于ELISA板，用間接ELISA法篩選了35例HFRS患者血清抗體識(shí)別的線性B細(xì)胞表位，并用競(jìng)爭(zhēng)ELISA證實(shí)了患者血清抗體與抗原肽結(jié)合的特異性。發(fā)現(xiàn)HFRS患者血清抗體識(shí)別的線性 B細(xì)胞表位主要在 NP氨基端（aa1-117），其次為

6、NP羧基端（aa361-429），在NP氨基酸序列的中部?jī)H有數(shù)個(gè)線性B細(xì)胞表位。發(fā)現(xiàn)一些患者血清抗原肽特異性IgG水平在急性期可有不同的變化。
　　同時(shí)，我們合成了覆蓋HTNV GP氨基酸全序列的281條重疊15肽，利用間接ELISA和點(diǎn)雜交兩種PepScan法對(duì)3D8、3G1、8G3這3株鼠源性中和抗體識(shí)別的B細(xì)胞表位進(jìn)行表位作圖。首先，將合成的281條重疊多肽分成28組，每10條肽為一組，混合后包被于ELISA板或者NC膜上，

7、用上述3株單克隆抗體做“粗篩”；然后將與單克隆抗體呈陽(yáng)性反應(yīng)的混合肽中各組成肽分別包被ELISA板或NC膜繼續(xù)用單克隆抗體反應(yīng)，做“細(xì)篩”，從而確定各單克隆抗體識(shí)別的抗原肽。然后用競(jìng)爭(zhēng) ELISA證實(shí)抗原肽與中和抗體結(jié)合的特異性。我們發(fā)現(xiàn)單克隆抗體3D8和8G3識(shí)別HTNV GP抗原肽881-KGFLCPEFPGSFRKK-895，而單克隆抗體3G1可能識(shí)別由數(shù)個(gè)線性肽組成的構(gòu)象表位。由于原合成肽相鄰肽間相差4個(gè)氨基酸殘基，因此又追加合

8、成了與881-KGFLCPEFPGSFRKK-895分別相差3個(gè)、2個(gè)、1個(gè)氨基酸殘基的15肽。將這些肽包被于ELISA板或NC膜上與單克隆抗體3D8反應(yīng)，進(jìn)行單克隆抗體3D8識(shí)別線性 B細(xì)胞表位的精細(xì)定位。我們發(fā)現(xiàn)單克隆抗體3D8與882-GFLCPEFPGSFRKKC-896反應(yīng)最強(qiáng)烈。接著，用丙氨酸掃描突變法分析882-GFLCPEFPGSFRKKC-896這條抗原肽發(fā)揮主要作用的氨基酸殘基，發(fā)現(xiàn)aa885C、aa896C是該抗原

9、肽表位最關(guān)鍵的氨基酸殘基，aa882G、aa883F、aa884L、aa893R、aa894K、aa895K對(duì)單克隆抗體3D8識(shí)別這個(gè)抗原肽表位也有重要影響。
　　本論文首次系統(tǒng)分析了腎綜合征出血熱患者血清抗體識(shí)別的HTNV核蛋白線性B細(xì)胞表位，對(duì)具有中和作用的單克隆抗體3D8的B細(xì)胞表位作圖確定了漢灘病毒糖蛋白上一個(gè)新的中和表位。這一結(jié)果不僅為深入探討HTNV感染引起的體液免疫應(yīng)答規(guī)律以及研制新型疫苗提供了理論依據(jù)，同時(shí)為搞清單