登革病毒包膜EDⅢ蛋白中和抗體結(jié)合表位篩選及鑒定.pdf

1、登革熱(Dengue fever，DF)是由登革病毒(Dengue virus，DENV)感染所引起的一種蟲媒傳染性疾病，輕者主要引起無癥狀感染或者產(chǎn)生輕微的癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致發(fā)生登革出血熱（Dengue hemorrhagic fever，DHF）和登革休克綜合征(Dengue shock syndrome，DSS)。WHO2014年2月發(fā)布的報(bào)告稱登革熱為全球蔓延最快的病媒傳播疾病，發(fā)病數(shù)量在過去50年間增加了約30倍。已構(gòu)成美洲、

2、東南亞、西太平洋地區(qū)的嚴(yán)重的健康問題和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。2014年，登革熱在我國(guó)南方（主要是廣東省）再次發(fā)生大流行，僅廣東省累積報(bào)告登革熱病例超過45000例，再次敲響了防治登革熱的警鐘。
　　在目前尚無登革特異性治療藥物批準(zhǔn)的情況下，登革疫苗的研發(fā)愈發(fā)重要。目前有數(shù)個(gè)登革疫苗正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，僅有一種疫苗通過Ⅲ期臨床試驗(yàn)，但此疫苗對(duì)不同血清型登革病毒保護(hù)性差異較大，尤其對(duì)2型登革病毒幾乎無保護(hù)作用。鑒于登革病毒多種血清型及其致病機(jī)制的復(fù)

3、雜性，尤其二次感染異型登革病毒所產(chǎn)生的抗體增強(qiáng)作用(ADE)更是成為疫苗研發(fā)的重要掣肘。
　　登革病毒屬于黃病毒家族，為有包膜的單正鏈RNA病毒，包括四種不同的血清型，基因組長(zhǎng)度約11kb，編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白（C，衣殼蛋白;M，膜蛋白;E，包膜蛋白）及7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。其中，由于E蛋白暴露在病毒表面，是誘導(dǎo)登革病毒中和抗體產(chǎn)生的主要蛋白，也是與疫苗研究相關(guān)的主要蛋白;非

4、結(jié)構(gòu)蛋白參與登革病毒生活周期的重要環(huán)節(jié)，相關(guān)研究主要用于體外診斷試劑的研發(fā)上。E蛋白含有3個(gè)功能區(qū)，Ⅰ區(qū)(EDI)位于中心;Ⅱ區(qū)(EDⅡ)位于側(cè)面，含融合環(huán);Ⅲ區(qū)(EDⅢ)呈免疫球蛋白樣折疊，被認(rèn)為能夠與細(xì)胞表面受體結(jié)合及中和抗體的主要靶點(diǎn)，登革熱疫苗研究的靶標(biāo)也多集中于EDⅢ蛋白。
　　研究表明，從感染登革病毒患者體內(nèi)分離的登革病毒抗體中含有交叉反應(yīng)性及型特異性EDⅢ抗體，且抗登革病毒諸多成分的抗體中，EDⅢ抗體在Vero細(xì)胞感

5、染模型中具有最強(qiáng)的中和活性。重組EDⅢ蛋白鼠源單抗亦具有體內(nèi)外中和作用。已經(jīng)證實(shí)去除登革病毒感染患者恢復(fù)期血清中EDⅢ抗體并不改變?cè)撗宓闹泻妥饔眉癆DE作用，可能原因?yàn)榛颊哐逯锌笶DⅢ抗體含量低，在整個(gè)血清保護(hù)作用中占的比例較低。但是如能夠促進(jìn)患者體內(nèi)EDⅢ抗體的產(chǎn)生并達(dá)到有效濃度，EDⅢ抗體很可能具有強(qiáng)大的中和保護(hù)作用，因而具備作為治療性抗體的潛能。而患者體內(nèi)EDⅢ抗體產(chǎn)生較少的直接原因可能是作為登革病毒多種抗原成份之一的EDⅢ蛋

6、白在自然感染的抗原競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì)，從而不能誘導(dǎo)有效的抗體反應(yīng)。因此解析EDⅢ蛋白中和表位，進(jìn)而制備亞單位疫苗避免多種成份的抗原競(jìng)爭(zhēng)仍是重要的疫苗研發(fā)策略，亦是本研究的切入點(diǎn)。
　　在本實(shí)驗(yàn)室前期工作中，用DENV1-4 EDⅢ重組蛋白免疫小鼠制備了一批EDⅢ蛋白鼠源性單克隆抗體，并用免疫學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行了鑒定。本研究的思路是，在與四種血清型EDⅢ蛋白均發(fā)生交叉反應(yīng)的單抗中，以體外微中和實(shí)驗(yàn)方法(Enzyme-linked immun

7、e spot-based micro-neutralization test,ELISPOT-MNT)，鑒定出2株單抗對(duì)不同血清型登革病毒具有較好的體外中和作用，單抗克隆號(hào)為2B11A35和2D73A7，再?gòu)氖删w展示肽庫中篩選其可能的抗原結(jié)合表位，尋找具有四型登革病毒交叉保護(hù)性抗體結(jié)合EDⅢ蛋白的表位特征，并為進(jìn)一步探索其結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系提供參考。
　　一、登革病毒EDⅢ蛋白單克隆抗體交叉中和活性的鑒定
　　由于登革病

8、毒多種血清型及致病機(jī)制的復(fù)雜性，理想的疫苗應(yīng)誘導(dǎo)出針對(duì)四種登革血清型的交叉中和抗體，理想的靶點(diǎn)為存在于4種血清型病毒的保守表位，因此本部分內(nèi)容旨在尋找對(duì)四種血清型登革病毒具交叉保護(hù)作用的單抗。我們從實(shí)驗(yàn)室前期制備的27株能與四種血清型登革病毒EDⅢ蛋白交叉反應(yīng)的單抗中，運(yùn)用ELISPOT-MNT微中和實(shí)驗(yàn)方法，鑒定出2株對(duì)不同血清型登革病毒具有較好保護(hù)作用的單抗。本章工作將單抗分別與四種血清型登革病毒孵育后感染LLC-MK2細(xì)胞，通過斑

9、點(diǎn)顯色的方法，檢測(cè)并計(jì)數(shù)被感染細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果顯示單抗與病毒孵育后能明顯降低病毒對(duì)細(xì)胞的感染，隨著單抗?jié)舛鹊脑黾?，被感染的?xì)胞數(shù)明顯減少，直到能完全保護(hù)細(xì)胞不被感染。其中，單抗2B11A35對(duì)1、2、3型登革病毒有較好的中和活性，50％抑制濃度(IC50)均小于1.5μg/ml，但是對(duì)4型登革病毒中和活性較差，IC50＞80μg/ml;單抗2D73A7對(duì)2、3型登革病毒有較好的中和活性，IC50＜3.5μg/ml，對(duì)4型登革病毒中和活性

10、次之，IC50＜8μg/ml，對(duì)1型登革病毒的中和活性最差，IC50＞200μg/ml。
　　本部分內(nèi)容鑒定出兩株具有交叉保護(hù)作用的單克隆抗體，這兩株單抗對(duì)不同血清型登革病毒具有明確的中和作用。理論上，具有交叉中和作用的單抗結(jié)合的應(yīng)該是不同血清型登革病毒EDⅢ蛋白上的保守表位，交叉中和單抗結(jié)合EDⅢ蛋白表位特征值得進(jìn)一步研究。
　　二、單抗2B11A35和2D73A7結(jié)合表位的篩選與鑒定
　　用交叉中和單抗2B11A3

11、5和2D73A7分別從噬菌體隨機(jī)展示線性12肽庫（linear dodecapeptide phage display libraries，Ph.D.-12）和噬菌體隨機(jī)展示環(huán)狀7肽庫（loop-constrained heptapeptide phage display libraries，Ph.D.-C7C）中篩選與單抗特異性結(jié)合的噬菌體克隆。用單抗2B11A35對(duì)線性肽庫(Ph.D.-12)進(jìn)行了3輪淘選，噬菌體滴度富集了7500

12、倍，從第三輪洗脫產(chǎn)物中挑選了20個(gè)噬菌體克隆;用單抗2B11A35對(duì)環(huán)7肽庫（Ph.D.-C7C）進(jìn)行了3輪淘選，噬菌體滴度富集了673倍，從第三輪洗脫產(chǎn)物中挑選了20個(gè)噬菌體克隆;用單抗2D73A7對(duì)Ph.D.-12對(duì)進(jìn)行了3輪淘選，噬菌體滴度富集了5396倍，從第三輪洗脫產(chǎn)物中挑選了30個(gè)噬菌體克隆;用單抗2D73A7對(duì)Ph.D.-C7C進(jìn)行了4輪淘選，噬菌體滴度富集了5111倍，從第四輪洗脫產(chǎn)物中挑選了20個(gè)噬菌體克隆。采用結(jié)合E

13、LISA鑒定單抗與噬菌體克隆結(jié)合情況，結(jié)果獲得17個(gè)與單抗2B11A35特異性結(jié)合的Ph.D.-12克隆，20個(gè)Ph.D.-C7C克隆;26個(gè)結(jié)合單抗2D73A7的Ph.D.-12克隆和18個(gè)Ph.D.-C7C克隆。所有陽性克隆均排除了吸板序列的可能性，且與無關(guān)單抗不結(jié)合。
　　對(duì)所獲陽性克隆分別進(jìn)行擴(kuò)增、DNA提取并全部送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。單抗2B11A35篩選的17個(gè)Ph.D.-12克隆中重復(fù)性最高的序列分別為

14、THNGPGRFTGIL、THYCAWDQKNCL和THQPQPKIPAVT;20個(gè)Ph.D.-C7C克隆中重復(fù)性最高的序列WHGHPHH和GHDLHPA。單抗2D73A7篩選到的26個(gè)Ph.D.-12克隆中重復(fù)性最高的序列分別為L(zhǎng)HRYSPDGASYA和LHRYDVSNNLPN;18個(gè)Ph.D.-C7C克隆中重復(fù)性最高的序列PMYGWDM和WAYGFNM。表位預(yù)測(cè)結(jié)果表明兩株單抗結(jié)合EDⅢ蛋白構(gòu)象表位，且兩株單抗結(jié)合表位在EDⅢ蛋白上

15、有重疊，但跨度不同。
　　結(jié)合前期ELISA鑒定結(jié)果及測(cè)序分析，將單抗2B11A35篩選的Ph.D.-12中含重復(fù)性較高，且ELISA結(jié)果顯示結(jié)合特異性較好的序列進(jìn)行化學(xué)合成。最終選出4個(gè)線性12肽序列，分別為No.1 HSTHNGPGRFTGILGG，No.9HSYSLEPTHRNHNHGG,No.11 HSHDARYHLHLKPTGG, No.14HSTHQPQPKIPAVTGG。因合成肽的N端偶聯(lián)有生物素，合成肽抗原性的鑒定

16、采用了四種不同ELISA實(shí)驗(yàn)方案，結(jié)果四種實(shí)驗(yàn)方案均無法檢測(cè)到單抗與合成肽的結(jié)合，且將合成肽與雞卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)偶聯(lián)后與單抗仍不結(jié)合，但與登革病毒EDⅢ蛋白免疫的兔血清存在著較弱非特異性結(jié)合。究其原因主要是合成構(gòu)象性表位短肽難以獲得可展示在噬菌體表面上的抗原性。
　　三、噬菌體免疫小鼠評(píng)價(jià)篩選模擬肽的免疫原性
　　將單抗2B11A35篩選Ph.D.-12得到的1、9、11、14號(hào)噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增并純

17、化，與弗氏佐劑乳化后以固定滴度(1012pfu/ml)免疫免疫BALB/C小鼠，同時(shí)用空載體噬菌體免疫作為對(duì)照。三輪免疫后，收獲的小鼠抗血清能較好的與噬菌體結(jié)合，血清效價(jià)約為800，同時(shí)免疫小鼠血清也能與1、3、4型DENVEDⅢ蛋白及2型登革病毒感染Vero細(xì)胞結(jié)合。結(jié)果表明所篩選的噬菌體展示肽能夠模擬DENV EDⅢ蛋白上單抗2B11A35識(shí)別的表位，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)4種血清型登革病毒的交叉抗體反應(yīng)，提示上述序列模擬了不同血清型登革