炭疽桿菌保護(hù)性抗原的克隆表達(dá)、純化及鑒定.pdf

1、目的：選擇編碼炭疽桿菌保護(hù)性抗原PA(protectiveantigen)的基因Pag,以炭疽桿菌A16R菌株為模板，克隆炭疽桿菌Pag基因，構(gòu)建表達(dá)載體并在原核細(xì)胞中進(jìn)行功能性表達(dá)，為炭疽桿菌亞單位疫苗的研制提供基礎(chǔ)。 方法：參考Pet-32a載體序列多克隆位點(diǎn)，根據(jù)Pag基因序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)獲得目的片段，測(cè)序正確后構(gòu)建到原核表達(dá)載體Pet-32a，構(gòu)建載體命名Pet-32a-PA。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌B

2、L21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)ELISA和Western-Blot等方法進(jìn)行特異性鑒定。 結(jié)果：構(gòu)建出Pet-32a-PA表達(dá)載體，經(jīng)DNA序列分析和雙酶切鑒定證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建正確，并均能在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)內(nèi)表達(dá)。其表達(dá)形式為包涵體，經(jīng)過(guò)變性、純化、復(fù)性后通過(guò)ELISA和Western-Blot證實(shí)得到了具有活性的PA蛋白。 結(jié)論：成功構(gòu)建出Pet-32a-PA表達(dá)載體，其蛋白表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)復(fù)性后具有活性