壞死梭桿菌保護性抗原確定與基因篩選研究.pdf

1、本項研究建立了壞死梭桿菌FN(A)P2001小鼠感染模型，對壞死梭桿菌免疫原及保護性抗原進行了篩選研究，通過對保護性抗原的氨基酸序列測定和基因篩選研究，結合保護性抗原的生物學試驗，確定溶血素是壞死梭桿菌的保護性抗原，是致病的主要物質。該項研究為壞死梭桿菌疫苗研制及免疫機理研究打下了基礎。試驗結果如下： 實驗將鹿源壞死梭桿菌FN(A)p2001分離株以不同菌量，不同途徑接種于小鼠，逐日觀察小鼠感染情況，死亡小鼠進行病理學檢查和細菌

2、分離鑒定。結果表明，壞死梭桿菌FN(A)P2001分離株具有很強的感染毒力，對小鼠的最小致死量為106個/只菌量，腹腔接種是適宜的感染途徑，從而建立了壞死梭桿菌分離株小鼠感染模型。 將壞死桿菌菌體裂解，分別將上清和沉淀制成抗原，免疫家兔制備抗血清，利用抗血清通過SDS-PAGE電泳及Western-blot技術對免疫組分進行篩選研究?；厥针s交陽性的蛋白條帶，分別免疫小鼠，利用對流免疫電泳檢測血清抗體。結果，F(xiàn)N(A)型菌株的3條

3、蛋白帶和FN(AB)型菌株的1條蛋白帶有免疫原性。 分別切取FN(A)型菌株和FN(AB)型菌株有免疫原性的蛋白帶，免疫小鼠。用對流免疫電泳試驗檢測免疫效果。免疫4周后進行攻毒(107個菌/只)。結果FN(A)型菌的55KD抗原有免疫保護性。用55KD抗原免疫血清，分別與各菌株裂解抗原進行瓊脂擴散試驗，結果，F(xiàn)N(AB)型菌裂解抗原與免疫血清間無沉淀線，F(xiàn)N(A)型菌的5株菌與免疫血清間有沉淀線，且沉淀線末端完全融合。證明FN(

4、A)型菌的5個菌株的抗原可產(chǎn)生交叉免疫反應，并具有相同的抗原決定簇。 將壞死梭桿菌FN(A)型菌的2菌株培養(yǎng)后離心，沉淀用滅菌去離子水稀釋，加胰酶裂解菌體。菌體上清液用60％飽和度的硫酸銨鹽析，沉淀經(jīng)懸浮式透析裝置透析，收集樣品。將透析后的粗分離保護性抗原樣品用凝膠層析柱分離純化，經(jīng)15％SDS-PAGE電泳及Western-blot選出目的蛋白帶，轉印到PVDF膜上，進行蛋白質N末端序列測定。結果2株FN(A)型壞死梭桿菌提取

5、的保護性抗原，N端氨基酸序列基本相同(各測10個氨基酸，只有第一位不同)。經(jīng)GenBank檢索，在已報道的壞死梭桿菌蛋白質氨基酸序列中未發(fā)現(xiàn)與測序結果相同的序列。 依據(jù)測出的氨基酸序列，設計簡并性引物及反向PCR引物。以簡并性引物與隨機引物篩選、反向PCR篩選法、以及目的基因富集篩選方法對抗原基因進行篩選。對篩選出的序列利用NCBI和EBI中的BLAST和Clustal進行氨基酸序列的同源性分析、序列比對及核苷酸序列拼接。通過對