牛分枝桿菌主要保護性抗原基因的克隆、表達及免疫研究.pdf

1、牛結核病(Bovinetuberculosis)主要是由牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的一種人獸共患傳染病，該病的流行與傳播不僅嚴重地影響著畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展，而且也嚴重地威脅和危害著人類的生命與健康，被國際獸疫局(OIE)列為B類傳染病。人結核病的10％以上是由牛分枝桿菌引起的。近年來，人結核病在世界范圍內大幅回升，每年死亡人數高達300萬，是其它傳染病死亡人數之和，當屬傳染病之魁首。由于牛結核病的存在，致使人結

2、核病最終無法根除。近年來，牛結核病在全球范圍內也呈上升趨勢，尤其是在廣大的發(fā)展中國家流行嚴重，我國牛結核的陽性檢出率為10％左右。在牛結核病的預防上，目前唯一可用的疫苗就是卡介苗(BCG)，但是接種BCG后免疫效果不確定，同時還干擾牛PPD的變態(tài)反應檢測，無法區(qū)別是自然感染還是人工免疫，給日常檢疫工作帶來了相當的困難。因此研發(fā)牛結核病的新型診斷和預防制劑已成為控制牛結核病的研究熱點。 結核分枝桿菌是細胞內寄生菌，機體抵抗結核分枝

3、桿菌的感染主要依靠細胞免疫。研究發(fā)現，結核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中存在的大量分泌蛋白能有效地誘發(fā)對結核分枝桿菌的抵抗性，產生免疫保護作用，因此分泌蛋白是保護性抗原。DNA疫苗能有效地刺激機體產生持久的體液免疫和細胞免疫應答，而且DNA疫苗在細胞內表達的蛋白抗原通過MHCⅠ類分子呈遞抗原，激活CTL及殺滅靶細胞是DNA疫苗發(fā)揮保護作用的最主要機制之一，這正是抗結核感染所必需的。另有研究指出，DNA疫苗免疫后，不干擾結核病的變態(tài)反應檢測。為了研制

4、牛結核病敏感、特異的診斷試劑和新型、高效的預防制劑，尤其是DNA疫苗，本研究進行了以下幾方面的工作： 1、牛分枝桿菌主要保護性抗原基因的克隆篩選了M.bovisAg85A、Ag85B、MPB51、MPB63、MPB70、MPB83和ESAT-6七種分泌蛋白的保護性抗原基因。以M.bovisVallee1ll染色體DNA為模板，以Ag85A、Ag85B、MPB51、MPB63、MPB70、MPB83和ESAT-6成熟蛋白基因特異性

5、引物進行PCR擴增，分別擴增出888bp、858bp、801bp、390bp、492bp、603bp和288bp的DNA片段。通過T-A克隆技術，將PCR產物克隆至pGEM-TVector中，以α-互補法、質粒大小鑒定、酶切鑒定、PCR鑒定及序列分析鑒定重組克隆，成功地構建出克隆質粒pGEM-T-85A、pGEM-T-85B、pGEM-T-51、pGEM-T-63、pGEM-T-70、pGEM-T-83、pGEM-T-ESAT-6。序列

6、測定及同源性分析表明，所獲得的M.bovisVallee111成熟蛋白基因與M.bovis中其它菌株相應基因具有高度的同源性。 2、主要保護性抗原基因的原核表達為了獲得M.bovis七個保護性抗原基因的表達產物，將克隆質粒pGEM-T-85A、pGEM-T-85B、pGEM-T-51、pGEM-T-63、pGEM-T-70、pGEM-T-83、pGEM-T-ESAT-6中的Ag85A、Ag85B、MPB51、MPB63、MPB7

7、0、MPB83和ESAT-6基因分別亞克隆至原核表達載體pET28a及pGEX-4T-3中，分別構建出原核表達重組質粒pET28a-85A、pET28a-85B、pET28a-51、pET28a-63、pET28a-70、pET28a-83及pGEX-4T-3-ESAT-6。重組表達質粒轉化至E.coliBL21(DE3)中，經IPTG誘導和SDS-PAGE分析，分別獲得了32kDa、30kDa、30kDa、18kDa、25kDa、26

8、kDa和34kDa的融合目的蛋白。Westernblot分析表明，所表達的目的蛋白均具有牛分枝桿菌的抗原性。經分析發(fā)現，只有MPB63主要以可溶性蛋白的形式表達，而其它目的蛋白則主要以包涵體的形式表達。采用冰浴超聲波裂解法破碎細菌，經TritonX-100的緩沖液反復洗滌，制備包涵體，通過SDS-PAGE對表達的目的蛋白進行了純化，再經SDS-PAGE檢測發(fā)現，純化的目的蛋白僅表現為單一條帶，從而作為真核重組表達質粒免疫效果的檢測抗原。

9、 3、主要保護性抗原基因的真核表達為了構建DNA疫苗，將克隆質粒pGEM-T-85A、pGEM-T-85B、pGEM-T-51、pGEM-T-63、pGEM-T-70、pGEM-T-83、pGEM-T-ESAT-6中的Ag85A、Ag85B、MPB51、MPB63、MPB70、MPB83和ESAT-6基因分別亞克隆至真核表達載體pVAX1中，成功地構建出真核重組表達質粒pVAX1-85A、pVAX1-85B、pVAX1-51、p

10、VAX1-63、pVAX1-70、pVAX1-83及pVAX1-ESAT-6。以脂質體介導法將真核重組表達質粒轉染至BHK-21細胞中，通過熒光抗體技術和RT-PCR技術證實目的基因在哺乳動物細胞中獲得了表達。 4、真核重組表達質粒的免疫研究為研究真核重組表達質粒的免疫特性，以pVAX1-85A、pVAX1-85B、pVAX1-51、pVAX1-63、pVAX1-70、pVAX1-83、pVAX1-ESAT-6單個質粒和pVAX

11、1-85B、pVAX1-70、pVAX1-83及pVAX1-ESAT-6四個質粒聯合分別對BALB/c小鼠進行了免疫，同時設pVAX1、生理鹽水和BCG對照組。間接ELISA檢測結果顯示，免疫小鼠體內產生了針對Ag85A、Ag85B、MPB51、MPB63、MPB70、MPB83、ESAT-6抗原的特異性抗體，抗體水平隨著免疫次數的增加而升高，而且聯免組的體液免疫水平顯著地高于單免組(P＜0.05)，但仍不及BCG對照組，這一結果并未達

12、到國外報道的那樣“多價聯合DNA疫苗比活的BCG誘導的保護作用更為強烈”。淋巴細胞轉化試驗結果表明，除pVAX1-85A免疫組外，其它重組質粒免疫組均產生了相當于BCG或略高于BCG水平的細胞免疫。CD4+T、CD8+T細胞檢測結果顯示，重組質粒免疫組均產生了明顯(聯免組)或顯著的以CD8+T細胞為主的細胞免疫(P＜0.05)，說明重組質粒DNA在攝取的細胞內表達的蛋白抗原主要通過MHCⅠ類分子呈遞抗原，激活CD8+T細胞，表現出較強的

13、CD8+T細胞免疫應答反應。其中pVAX1-51表達的蛋白抗原還可以通過MHCⅡ類分子呈遞抗原，激活CD4+T細胞，表現出更高的細胞免疫水平。另外，以pVAX1-70、pVAX1-83單個質粒和pVAX1-70、pVAX1-83兩個質粒聯合分別對豚鼠進行了免疫，同時設pVAX1和BCG對照組。淋巴細胞轉化試驗結果顯示，重組質粒免疫組均產生了相當于BCG或高于BCG水平的細胞免疫，這一結果與小鼠免疫結果一致。牛PPD皮試結果顯示，重組質粒

14、免疫組與BCG組差異極顯著(P＜0.01，P=0.0001)，表明重組質粒免疫并不干擾牛PPD變態(tài)反應檢測，這一結果與國外報道的研究結果一致。 上述研究結果表明，本研究獲得了M.bovisAg85A、Ag85B、MPB51、MPB63、MPB70、MPB83和ESAT-6七個保護性抗原基因的原核表達產物，為研究其免疫生化特性及作為新型診斷試劑奠定了基礎。構建的真核表達載體，在實驗動物體內均產生了特異性的體液免疫和細胞免疫。為進一