幽門螺桿菌主要保護(hù)性抗原的基因克隆、表達(dá)、單克隆抗體制備及其B細(xì)胞表位的鑒定.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori,np)是一種長期定植于人體胃黏膜的微需氧、革蘭氏陰性螺旋形細(xì)菌。大量研究證實，Hp的長期感染是慢性消化道疾病如B型(胃竇)胃炎、消化性潰瘍、胃粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT)胃癌等發(fā)生、發(fā)展的重要原因，世界衛(wèi)生組織(WHO)已將其列為Ⅰ級致癌物質(zhì)，全世界約有50％的人口感染Hp。盡管抗生素仍然是當(dāng)前治療Hp感染最有效的方法，但由于感染范圍廣，藥物的不良反應(yīng)、耐藥菌株逐年增多

2、，且停藥后易反復(fù)再感染等因素，使藥物治療的臨床應(yīng)用受到極大限制。隨著人們對Hp基因組到蛋白質(zhì)組全面深入的解析，通過疫苗來防治Hp的感染成為可能，并逐漸成為研究的熱點(diǎn)。已有研究表明，免疫接種可預(yù)防甚至治療np的感染，使人群獲得持久和較強(qiáng)的免疫力，所以Hp疫苗的研究具有重要的意義。 在一般情況下，Hp自然感染時體內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，但是感染仍呈慢性持續(xù)化甚至終身感染，表明機(jī)體存在免疫耐受狀態(tài)，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答不能起到免疫保護(hù)作用，因

3、而研制Hp疫苗必須選擇有保護(hù)性作用的抗原并對其進(jìn)行改造，以激發(fā)更有效的免疫反應(yīng)。隨著Hp基因組、蛋白質(zhì)組、免疫組及疫苗組等研究的深入，許多在抗Hp感染中具有重要功能的保護(hù)性抗原相繼被發(fā)現(xiàn)，這為闡明Hp在人體中的入侵、致病、免疫機(jī)制及為研制新一代Hp疫苗提供了基礎(chǔ)。研究表明，空泡毒素(Vacuolating cytotoxin,VacA)、脂蛋白(lipoprotein 20，Lpp201)、熱休克蛋白(Heat shot protein

4、 A,HspA)、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白(cytotoxin-assosiatedgene A,CagA)、尿素酶A(UreaseA)、尿素酶B(Urease B)、過氧化氫酶(Catalase)、中性粒細(xì)胞激活蛋白(Neutrophil-activating protein，NapA)及黏附素(Adhesion)等主要保護(hù)性抗原都可以單獨(dú)作為抗原，在動物實驗中均表現(xiàn)出一定的免疫保護(hù)作用，但單獨(dú)使用上述保護(hù)性抗原作為疫苗時，其保護(hù)性具有一定的

5、局限性，表現(xiàn)為免疫原性弱，不能激發(fā)有效的免疫應(yīng)答。當(dāng)機(jī)體再次感染Hp時，不能產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)對抗感染。Telford<'[3]>等實驗表明，Hp單一抗原的保護(hù)率幾乎均低于80％，二種或二種以上Hp抗原組合的疫苗有理想的保護(hù)效果。雖然采用保護(hù)性抗原全分子的聯(lián)合疫苗可顯著提高疫苗的保護(hù)性，但同時不可避免對人體帶來較嚴(yán)重的毒副作用。為了進(jìn)一步提高疫苗的安全性和有效性，研制基于Hp主要保護(hù)性抗原的表位亞單位疫苗將成為研制Hp疫苗新的發(fā)展方向。

6、 Hp感染宿主的免疫機(jī)制表明，宿主可能通過特異性和非特異性免疫反應(yīng)對抗Hp的感染。在特異性免疫反應(yīng)中，由于Hp的感染主要是胞外感染，抗原誘發(fā)的抗體反應(yīng)可能在HP的免疫保護(hù)中起主要作用，因此Hp主要保護(hù)性抗原的B細(xì)胞表位的鑒定也就變的尤為重要。本研究利用噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)對Hp主要保護(hù)性抗原的B細(xì)胞表位進(jìn)行了鑒定和研究。 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，本研究選取Lpp20、HspA、UreaseA、CagA、UreaseB、Catalase六

7、種Hp主要保護(hù)性抗原作為侯選靶分子進(jìn)行研究。首先，根據(jù)GenBank中登錄的Hp標(biāo)準(zhǔn)株26695序列設(shè)計了針對Lpp20等六種抗原基因的特異性引物，利用PCR技術(shù)從Hp DNA染色體中擴(kuò)增出Lpp20等六種抗原的編碼基因片段，先將其T-A克隆和測序，結(jié)果顯示擴(kuò)增的Lpp20、HspA、UreaseA、CagA、UreaseB、Catalase基因的長度分別為528bp、351bp、675bp、855bp、1704bp、1515bp，并登

8、錄在GenBank上(登錄號分別為DQ106902、DQ141574、DQ141577、DQ141575、DQ141576、DQ333889)，與GenBank公布的其它菌株的核酸和氨基酸序列進(jìn)行比對，同源性很高。再將目的基因克隆至融合表達(dá)載體pGEX-4T-1上，并在E.coliTOP10中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)的Lpp20、HspA、UreaseA、CagA、UreaseB、Catalase融合蛋白的相對分子量(Mr)分別約為48000Da

9、、41000Da、52000Da、60000Da、91000Da、85000Da。對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行超聲破菌，目的蛋白以可溶性的形式存在于上清中，利用Glutathione Sepharose 4B親和層析柱對破菌后的上清進(jìn)行了純化。Western-blotting鑒定結(jié)果顯示，六種抗原的純化產(chǎn)物均可被Hp感染病人血清特異性識別，說明重組表達(dá)的Lpp20等六種抗原均具有較好的抗原性。為制備抗Hp的單克隆抗體，將培養(yǎng)的Hp標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株混合物

10、超聲破菌后，以破菌后的上清和沉淀為免疫原分別免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)制備了34株單克隆抗體，目前已鑒定的部分單克隆抗體亞類均為IgGl K型，細(xì)胞培養(yǎng)上清的效價為1：32～1：128，腹水效價為1：32000～1：128000，抗體親和常數(shù)介于1×10<'8>L/M～1×10加L/M。用重組表達(dá)的Hp Lpp20、HspA、UreaseA、CagA、U=teaseB、Catalase六種蛋白通過ELISA結(jié)合Western-

11、b10tting實驗對抗體進(jìn)行了鑒定，獲得了分別針對這六種蛋白的特異性的單克隆抗體。用辣根過氧化物酶(HRP)對抗體進(jìn)行了標(biāo)記，并用競爭ELISA法鑒定抗體表位是否為同一表位，3株抗Lpp20抗體為同一表位，2株抗HspA抗體為同一表位，4株抗LJreaseA抗體為同一表位，6株抗UreaseB抗體為2個表位，2株Catalase抗體為同一表位?？笻p主要保護(hù)性抗原單克隆抗體的制備和鑒定，為下一步用噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)篩選和鑒定抗體結(jié)合抗

12、原決定蔟的的位點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。 為鑒定UreaseB抗原的B細(xì)胞表位，以抗UreaseB抗原的mAb U001篩選噬菌體隨機(jī)12肽庫，經(jīng)過3輪的淘篩，結(jié)合抗體的噬菌體得到富集，隨機(jī)挑取噬菌體克隆用ELISA方法檢測其與抗體的反應(yīng)。對15個陽性克隆的DNA單鏈進(jìn)行測序并推導(dǎo)其所編碼的氨基酸序列。陽性克隆大多數(shù)呈遞EHWSHMFDSPGD序列，將此序列與IJreaseB蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對，12肽序列的第l、5、6和7位置上的E、

13、H、D、M氨基酸與UreaseB蛋白的氨基酸殘基(347-353位)有較高的同源性，說明E、H、D、M可能決定了抗原表位的性質(zhì)，是構(gòu)成該抗原表位的關(guān)鍵氨基酸。競爭ELISA實驗表明這個噬菌體克隆能抑制UreaseB抗原與抗體的結(jié)合。用此噬菌體克隆免疫BALB/c小鼠，ELISA和Western-blotting實驗均證實抗血清識別UreaseB抗原。有國外學(xué)者對UreaseB抗原中和抗體的表位進(jìn)行鑒定，認(rèn)為UteaseB抗原的321-3

14、39位氨基酸殘基為中和表位位點(diǎn)，這一結(jié)果與我們獲得的結(jié)果位置相近，說明在UreaseB抗原上可能存在優(yōu)勢抗原表位。 為鑒定Lpp20抗原的B細(xì)胞表位，以抗Lpp20抗原的mAb L001篩選噬菌體隨機(jī)12肽庫，經(jīng)過3輪的淘篩，結(jié)合抗體的噬菌體得到富集，隨機(jī)挑取噬菌體克隆用ELISA方法檢測其與抗體的反應(yīng)。對15個陽性克隆的DNA單鏈進(jìn)行測序并推導(dǎo)其所編碼的氨基酸序列。陽性克隆大多數(shù)呈遞SWPLYSDASGLG序列，將此序列與Lp

15、p20蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對，12肽序列中的D、A、S、G氨基酸與Lpp20蛋白的氨基酸殘基(114-117位)完全同源，并且這幾個氨基酸完全連續(xù)在一起，說明D、A、S、G可能決定了抗原表位的性質(zhì)，是構(gòu)成該抗原表位的關(guān)鍵氨基酸，這個表位有可能是一個線性表位。競爭ELISA實驗表明這個噬菌體克隆能抑制Lpp20抗原與抗體的結(jié)合。用此噬菌體克隆免疫BALB/c小鼠，ELISA和Western-blotting實驗均證實抗血清識別l,pp2

16、0抗原。 為鑒定Catalase抗原的B細(xì)胞表位，以抗Catalase抗原的mAb C001篩選噬菌體隨機(jī)12肽庫，經(jīng)過3輪的淘篩，結(jié)合抗體的噬菌體得到富集，隨機(jī)挑取噬菌體克隆用ELISA方法檢測其與抗體的反應(yīng)。對15個陽性克隆的DNA單鏈進(jìn)行測序并推導(dǎo)其所編碼的氨基酸序列。陽性克隆大多數(shù)呈遞SVSLPYANLAHI序列，將此序列與Catalase蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對，12肽序列中的1、5、8、9、10位置上的氨基酸S、P、N

17、、L、A與Catalase氨基酸殘基(394-405位)有較高的同源性，說明S、P、N、L、A決定了抗原表位的性質(zhì)，可能是構(gòu)成該抗原表位的關(guān)鍵氨基酸。競爭抑制EL,ISA表明這個噬菌體克隆能抑制Catalase抗原與抗體的結(jié)合。用此噬菌體克隆免疫BALB/c小鼠檢，ELISA和Western-blotting均實驗證實抗血清識別Catalase抗原。 本研究通過噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)篩選和鑒定了Hp主要保護(hù)性抗原UreaseB、Lp