人胸腺素β4在大腸桿菌中的克隆、表達、純化及生物學活性鑒定.pdf

1、胸腺素β4是胸腺素的有效組分之一，為1981年Low等人從小牛胸腺中提取分離純化的，高度保守，由43個氨基酸組成，N端絲氨酸被乙?；入婞c為5.1，具有免疫調(diào)節(jié)的功能，是一種在多種組織均有表達的蛋白多肽，在體液，血液中均存在。大量的研究表明胸腺素B4能夠誘導內(nèi)皮細胞分化，促進血管生成，并能促進創(chuàng)傷的愈合和心肌梗塞時心肌細胞的存活和血管生成。胸腺素β4在治療皮膚、角膜創(chuàng)傷，治療心肌梗塞，抗腫瘤治療，抗炎等方面有著廣闊的應用前景，目前胸腺

2、素β4在治療創(chuàng)傷、心肌梗塞等方面已經(jīng)進入臨床試驗。由于天然狀態(tài)下胸腺素β4含量稀少，從組織中純化它的成本較高；化學合成方法可以獲得，但是價格昂貴。因此，本文利用基因工程技術對胸腺素β4在大腸桿菌中的表達進行了研究，以期為進一步研究其生物學功能奠定基礎。 (一)人胸腺素β4在原核系統(tǒng)中的克隆、表達及純化首先按照大腸桿菌密碼子嗜性對人胸腺素β4的基因序列進行改造，用化學法合成人胸腺素β4全基因序列，PCR方法擴增人胸腺素β4基因并在

3、其兩端引入Nde I和Xho I限制性酶切位點。將PCR擴增產(chǎn)物克隆至pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化DH5a，抽提質(zhì)粒，測序鑒定，把序列正確質(zhì)粒上的胸腺素β4基因亞克隆至原核表達載體pTXB1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566，在IPTG誘導表達，表達的融合蛋白約占菌體蛋白總量的50％，經(jīng)過超聲裂解，親和層析，柱上裂解釋放目的蛋白，超濾，脫鹽等處理得到重組人胸腺素β4純品。純化的胸腺素β4經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳分析只有一條帶，純度在90

4、％以上。 (二)人胸腺素β4蛋白理化特性的研究用Edman降解法對重組人胸腺素β4純品N端5個氨基酸測定，測序結(jié)果顯示重組蛋白的N端5個氨基酸為SDKPD，與天然胸腺素β4的一致；用ABI公司質(zhì)譜儀對重組蛋白分析，分析結(jié)果顯示重組蛋白具有預期的分子量，胰蛋白酶酶切肽譜測定結(jié)果顯示肽質(zhì)量圖譜匹配良好，這些結(jié)果表明重組蛋白就是人胸腺素β4。 (三)人胸腺素β4生物學活性檢測人胸腺素β4具有免疫調(diào)節(jié)的作用。參照相關文獻，用淋巴

5、細胞轉(zhuǎn)化試驗來檢測重組蛋白的生物學活性。本研究首先優(yōu)化了刀豆素A的最佳刺激濃度，選用終濃度4ug/ml的刀豆素A刺激淋巴細胞6小時，然后加入不同濃度的重組人胸腺素β4繼續(xù)培養(yǎng)至72小時，用MTT法檢測細胞的增殖。與化學合成的人胸腺素β4相比，重組人胸腺素β4具有相當?shù)纳飳W活性。 (四)人胸腺素β4在創(chuàng)傷愈合中的促進作用參照相關文獻，在Balb/c小鼠身上制造皮膚創(chuàng)傷模型，局部使用重組人胸腺素β4，組織學檢測表明重組人胸腺素β4