弓形蟲入侵相關蛋白MIC3的定位及其保護性研究.pdf

1、研究目的： (1) 觀察微線體蛋白在弓形蟲速殖子內的分布。 (2)觀察弓形蟲微線體MIC3DNA疫苗的免疫保護效果。 研究方法： (1)采用RT-PCR法從弓形蟲RH株擴增出微線體分泌蛋白MIC3編碼基因，亞克隆至真核表達載體，構建真核表達質粒pcDNA3-MIC3和綠色熒光表達質粒pEGFP-C2-MIC3。 (2)利用脂質體轉染法分別轉染真核表達質粒pcDNA3-MIC3和pEGFP-C2-M

2、IC3入體外培養(yǎng)的COS-7細胞，獲得重組蛋白，并通過SDS-PAGE和Western-blot等方法鑒定其表達；以熒光蛋白EGFP為標志觀察MIC3在真核細胞中的定位。 (3)利用電穿孔法轉染pEGFP-C2-MIC3入弓形蟲體內，通過EGFP的表達示蹤觀察MIC3在蟲體內的定位。 (4)大量制備并純化重組質粒pcDNA3-MIC3，采用肌肉注射法免疫小鼠后進行攻擊感染，觀察小鼠死亡時間、淋巴細胞轉化率、特異血清抗體和

3、脾淋巴細胞亞群中CD4+和CD8+比值等，以期闡明對機體免疫系統(tǒng)的影響。 研究結果： (1)成功構建重組質粒的pcDNA3-MIC3和pEGFP-C2-MIC3，DNA序列測定結果表明將大小為1080bp的MIC3片段分別克隆到pcDNA3的Hind Ⅲ/EcoR Ⅴ位點和pEGFP-C2的BgL Ⅱ/HidnⅢ。 (2)轉染pcDNA3-MIC3入COS-7細胞表達產物經SDS-PAGE凝膠電泳結果顯示42KD

4、a大小的條帶，Western-blot和ELISA進一步證實MIC3蛋白具有免疫學活性。 (3)脂質體法轉染pEGFP-C2-MIC3入COS-7細胞表達后的MIC3-EGFP融合蛋白呈點狀分布均勻地分布COS-7細胞的細胞質中并在核膜附近有強綠色熒光的聚集，聚集的形狀象英文字母“C”，而在細胞核內和細胞膜上沒有發(fā)現MIC3-EGFP融合蛋白的表達。通過電穿孔法轉染pEGFP-C2-MIC3入弓形蟲體內發(fā)現，熒光集中于蟲體頂端，

5、說明MIC3能夠靶向蟲體頂端細胞器。 (4)DNA疫苗免疫動物顯示，pcDNA3-MIC3能延長弓形蟲RH株攻擊感染的生存時間。同時，對免疫鼠研究發(fā)現，pcDNA3-MIC3能刺激機體產生較高水平的特異性抗體；pcDNA3-MIC3能使宿主脾細胞CD4+/CD8+比值下降，與對照組相比，P值均小于0.05。提示該DNA疫苗主要以CD8+的CTL細胞途徑激發(fā)機體的抗弓形蟲效應。 結論： 1.成功構建了兩個真核表達質

6、粒pcDNA3-MIC3和pEGFP-C2-MIC3 2.pcDNA3-MIC3成功地轉化入COS-7細胞，并獲得真核表達的MIC3蛋白，經Western-blot和ELISA分析顯示重組MIC3有特異性的免疫原性。 3.pEGFP-C2-MIC3成功轉染入COS-7細胞顯示MIC3定位于真核細胞的細胞質，轉染入弓形蟲體內結果顯示MIC3能能夠靶向蟲體頂端細胞器。 4.成功構建MIC3的DNA疫苗，動物結果顯示其