豬Bic基因兩種單倍型與Foxp3結(jié)合能力差異對miR-155表達(dá)影響的研究.pdf

1、豬的抗病育種一直是養(yǎng)豬科研的重點(diǎn)研究內(nèi)容，尤其是中外豬種的免疫力差異，從遺傳的角度來研究中國豬種的抗病力對豬的抗病新品種培育非常重要。miR-155在免疫平衡和免疫系統(tǒng)中起著關(guān)鍵的作用，并廣泛參與T細(xì)胞的活化、增殖和分化。本研究旨在利用凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)探究豬miR155宿主基因Bic內(nèi)含子的SNP與轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的結(jié)合能力差異，在個(gè)體水平利用流式細(xì)胞儀分選了兩種單倍型的Treg細(xì)胞并提取總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，對兩種單倍型個(gè)體的表達(dá)

2、譜芯片進(jìn)行了功能聚類，還檢測了Poly I∶C刺激情況下對miR155表達(dá)的影響及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的調(diào)控作用。具體結(jié)果如下:
　　(1)根據(jù)宿主基因Bic內(nèi)含子區(qū)域的Pre-miR155上游305bp和168bp這兩處發(fā)生A/C突變的SNP位點(diǎn)，利用PCR-RFLP技術(shù)在培育品種-湖北白豬中酶切鑒定了兩種單倍型AA和CC個(gè)體。
　　(2)利用流式細(xì)胞儀通過標(biāo)記CD3+CD4+CD25+三陽分選了AA和CC兩種單倍型的調(diào)節(jié)性

3、T細(xì)胞(Treg)，并利用微量RNA提取試劑盒抽提了Treg細(xì)胞的總RNA，將RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，數(shù)據(jù)分析得到與免疫系統(tǒng)相關(guān)的基因有126個(gè)，在CC單倍型Treg細(xì)胞內(nèi)上調(diào)表達(dá)的基因有122個(gè)，而下調(diào)表達(dá)的基因有4個(gè);通過差異基因聚類分析發(fā)現(xiàn)與免疫應(yīng)答相關(guān)的基因有23個(gè);找到10個(gè)miR155的靶基因，其中3個(gè)靶基因有顯著差異，另外7個(gè)沒有顯著差異，SOCS1以及SLA-6在CC單倍型Treg細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量較高，而MYLK在CC單倍型T

4、reg細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)。測序所得的核糖體RNA比例較高，有效數(shù)據(jù)量不大。
　　(3)在杜洛克x二花臉F2代群體酶切分型鑒定了兩種單倍型的個(gè)體，利用Affymetrix表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了AA單倍型和CC單倍型之間的差異基因篩選，通過對33d和35d的杜二F2群體表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析我們分別共檢測到554個(gè)和232個(gè)兩種單倍型之間差異表達(dá)的探針(p＜0.05)，然后將差異表達(dá)基因進(jìn)行功能聚類，篩選到與miR-155功能調(diào)控相關(guān)的基因包括E

5、TS2、ATF3、TGFβ-1、TGFB1、IL15、SLA-DRB1、SOCS1和CASP8。
　　(4)利用凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)技術(shù)探討豬的Foxp3蛋白與Bic基因中A/C型片段的結(jié)合能力差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Foxp3與AA型片段的結(jié)合能力較CC型要強(qiáng)。
　　(5)在巨噬細(xì)胞上驗(yàn)證Poly I∶C刺激情況下miR155的表達(dá)變化及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3對miR155的表達(dá)調(diào)控，結(jié)果表明miR155-5p的表達(dá)量在刺激12h內(nèi)有所上調(diào)