豬miR-155兩種基因型的性狀關聯(lián)分析的研究.pdf

1、微小RNA(microRNA)是非編碼RNA中最為人們熟悉的一個亞類，它廣泛的參與發(fā)育，細胞凋亡和細胞增值。miR-155在免疫系統(tǒng)發(fā)生發(fā)育及調控中扮演重要角色，其宿主基因上關鍵位點的突變可能導致miR-155表達量的改變，從而引起下游免疫系統(tǒng)的差異。我們根據(jù)miR-155宿主基因BIC(B-cellIntegration Cluster)上的SNP信息，利用PCR-RFLP方法在中外培育品種豬中鑒定了兩種基因型個體，利用流式細胞術分選

2、調節(jié)性T細胞(Regulatory T cell，Treg)以進行后續(xù)基因表達差異試驗驗證，同時統(tǒng)計分析了其中一個關鍵SNP的基因型與杜洛克×二花臉F2資源群體的免疫指標關聯(lián)性，具體結果如下:
　　(1)不同豬種兩種基因型個體的鑒定在miR-155宿主基因BIC上，我們將miR-155前體的第一個堿基以+1表示，上游305bp的A/C突變以-305bp表示，我們根據(jù)-305A/C這個SNP信息，在三個中外培育品種中尋找兩種基因型個

3、體。通過對55頭蘇鐘豬、300鄂通兩頭烏和250頭湖北白豬進行PCR-RFLP分析，在鄂通兩頭烏中挑選得到4頭AA型個體和3頭CC型個體，在湖北白豬中挑選到2頭AA型.個體和2頭CC型個體。在鄂通兩頭烏群體中，AA基因型頻率為0.0348，AC基因型頻率為0.4609，CC基因型頻率為0.5043。A的基因頻率為0.2653，C的基因頻率為0.7347。在湖北白豬群體中，AA基因型頻率為0.8279，AC基因型頻率為0.1680，CC基

4、因型頻率為0.0041。A的基因頻率為0.9119，C的基因頻率為0.0881。在檢測的55頭蘇鐘豬中，沒有發(fā)現(xiàn)CC型。AA基因型頻率為0.6545，AC基因型頻率為0.3455。A的基因頻率為0.8273，C的基因頻率為0.1727。
　　(2)兩種基因型豬血常規(guī)性狀差異分析利用Beckman Coulter Ac.Tdiff2血細胞分析儀對兩種基因型的鄂通兩頭烏進行血常規(guī)檢測，將4頭AA基因型個體和3頭CC基因型個體的血液指標

5、進行T檢驗分析。結果發(fā)現(xiàn):兩種基因型豬間，紅細胞平均體量（MCV，fL）存在差異(P＜0.05)，紅細胞體積分布寬度(RDW，％)存在顯著差異(P＜0.01)。
　　(3)MiR-155上游305A/C突變與F2群體一些免疫指標的關聯(lián)分析根據(jù)miR-155上游305bp的A/C突變對杜洛克×二花臉F2資源群體共計394頭個體進行分型，并在不同時間點與該群體的免疫指標進行關聯(lián)分析。結果表明:在F2群體中，AA基因型頻率為0.2507

6、，AC基因型頻率為0.5171，CC基因型頻率為0.2321。A的基因頻率為0.5092，C的基因頻率為0.4908。在20日齡時，miR-155前體上游305A/C突變對CD4-CD8+CD3-，CD4-CD8+CD3+細胞有顯著影響(P＜0.05)。在33日齡時，miR-155前體上游305A/C變異對紅細胞數(shù)(RBC)、紅細胞比容(HCT)和血紅蛋白含量(HGB)有顯著影響(p＜0.05)，對血小板體積分布寬度(PDW)和血小板平

7、均體積(MPV)有極顯著影響(p＜0.01)。在35日齡時，該SNP對血紅蛋白含量(HGB)、紅細胞比容(HCT)有顯著影響(p＜0.05)，對血小板體積分布寬度(PDW)有極顯著影響(p＜0.01)。在80日齡時，對嗜酸性粒細胞數(shù)(EO)，嗜酸性粒細胞比率(EOP)有顯著影響(p＜0.05)。該位點可能影響miR-155的表達，從而在個體生長的不同時間點，調控不同的通路，影響不同類型的免疫細胞的發(fā)育。
　　(4)兩種基因型豬的T

8、reg細胞分選利用流式細胞儀和三種不同熒光標記的抗體分選不同基因型豬的Treg。先根據(jù)總白細胞中不同細胞的物理參數(shù)（大小，濃度等）的不同分選出淋巴細胞，設置一個門，再從這個門中分選出CD3+的細胞類群，再從中選取CD4+細胞，最后再從CD4+T細胞中選擇CD25+細胞，最終得到Treg細胞，流式細胞分析結果表明豬Treg細胞占總白細胞的1％左右。
　　(5)體外實驗驗證miR-155對其靶基因的作用通過轉染mimic155到豬的巨