鞘糖脂Gb3的配體結構對其胞內運輸的影響.pdf

1、志賀(氏)菌毒素(Shiga toxin)是主要由痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae)產生的一種重要的致病毒力因子，由具有酶活性的A亞基和結合作用的B亞基兩部分構成。志賀(氏)菌毒素的受體為鞘糖脂Gb3(globotriaosylceramide)，其廣泛存在于哺乳動物細胞膜表面。志賀(氏)菌毒素經過復雜的胞吞途徑進入細胞內部殺死細胞。志賀(氏)菌毒素與細胞表面的Gb3受體結合后，經過逆轉運方式進入內質網，再由內質網最

2、終到達細胞質中。在細胞質之中，志賀(氏)菌毒素的酶活部分使28S rRNA失活，從而抑制蛋白的合成。但是，目前的研究對于毒素在胞內轉運的機制還有很多不清楚的地方。 本論文旨在研究志賀(氏)菌毒素B亞基N端的作用，通過基因克隆的方法對B亞基N端進行修飾，并對修飾后B亞基的胞內運輸進行研究。 本論文首先以pGlyc-KDEL質粒為模板擴增出STxB的基因序列，并將其連接到帶有GST的pGEX-4T-1骨架載體上，構建原核表達

3、載體GST-STxB-pGEX-4T-1，并在大腸桿菌DH5 α中通過IPTG誘導表達，然后利用谷胱苷肽Sepharose 4B凝膠親和層析對重組的蛋白進行純化。純化的蛋白采用SDS-PAGE和Western blot進行檢測，并且用高效液相Bio-silSEC 250凝膠柱對重組的蛋白進行分析，以確定其多聚體結構。 對重組純化后的GST-STxB蛋白進行了胞內運輸的研究。首先將N端修飾的蛋白GST-STxB和未做修飾的蛋白ST