鞘糖脂組學方法研究肝癌特征性鞘糖脂.pdf

1、第一章肝細胞肝癌實體瘤及相應癌旁組織中的鞘糖脂表達的質譜表征
　　目的：運用糖組學方法研究肝細胞肝癌患者實體瘤樣本中的鞘糖脂表達情況，對比同一個體來源的癌旁組織，找出明顯差異表達的鞘糖脂結構，從而找出肝細胞肝癌相關的特征性鞘糖脂為肝細胞肝癌診斷、治療等提供新的靶點，并為異常的鞘糖脂在肝細胞肝癌的生物學行為中所發(fā)生的作用提供初步的結構基礎。
　　方法：(1)采用有機試劑溶液超聲波組合式提取的技術從肝細胞肝癌的實體瘤樣本中提取出

2、總脂質；(2)利用DEAE-Sephedex A25層析法分離純化出酸中性鞘糖脂；(2)將所得的脂質用乙酰化修飾并用硅酸鎂柱層析的方法去除其中的磷脂類進一步純化鞘糖脂；(4)HPTLC的方法初步分析從肝癌和癌旁組織中提取出來的鞘糖脂；(5)完全甲基化方法修飾所分離純化的鞘糖脂，并經(jīng)由LTQ-ESI MS質譜技術進行初步分析；(6) ROC曲線法分析質譜數(shù)據(jù)中異常的鞘糖脂。
　　結果：(1)同一個體來源的肝癌和癌旁初級總離子流譜圖顯

3、示出在肝癌中的m/z1600到m/z2000范圍內出現(xiàn)的一群異常表達的鞘糖脂結構；(2)2級質譜分析研究的結果顯示有三組異常的鞘糖脂本別是m/z1086，m/z1260，m/z1290，這三組異常的鞘糖脂均為被巖藻糖基化所修飾，并發(fā)現(xiàn)這三組異常鞘糖脂在肝癌組織中的表達水平顯著高于相應癌旁組織中的表達水平；(3)通過 SPSS軟件的 ROC曲線法（受試者特征工作曲線）分析32對肝細胞肝癌患者的肝瘤組織以及相應的癌旁組織質譜總離子流圖數(shù)據(jù)發(fā)

4、現(xiàn)m/z1086的AUC（曲線下面積）值是0.809， m/z1260的AUC值是0.722，m/z1290的AUC值為0.953.
　　結論：肝細胞肝癌患者的實體瘤樣本中鞘糖脂的表達區(qū)別于同一個體來源的癌緣組織，其中在初級質譜數(shù)據(jù)上可見明顯的一系列鞘糖脂的異常表達，這些明顯異常表達的鞘糖脂經(jīng)初步的結構定性發(fā)現(xiàn)均為巖藻糖基化修飾的鞘糖脂結構，受試者特征曲線說明一群三組巖藻糖基化的鞘糖脂其作為診斷靶點具有診斷效力，說明異常的巖藻糖基

5、化鞘糖脂作為治療診斷治療靶點的潛在價值。
　　第二章肝細胞肝癌中異常巖藻糖基化鞘糖脂的定性分析及其作為潛在靶點的結構基礎
　　目的：通過質譜準確定性異常的巖藻糖基化的鞘糖脂所有的結構，并找出其中可以作為診斷治療靶點的的可能結構基礎。
　　方法：(1)利用多級質譜方法結合相關的鞘糖脂標準品進行精確的異常鞘糖脂結構的表征；(2) ChemDraw等結構分析軟件的結合多級質譜法結合定性；(3)多級質譜檢測肝癌細胞系的異常巖藻

6、糖基化鞘糖脂表達情況；(4)多級質譜檢測肝癌病患血清中異常巖藻糖基化鞘糖脂表達情況(5)采用Real-Time PCR技術檢測肝癌組織中相關巖藻糖基轉移酶的表達情況。
　　結果：(1)多級質譜對異常巖藻糖基化的鞘糖脂表征揭示其中含有TypeⅠ/ⅡH antigen，Lewis x，Lewisy，Lewis a，Lewis b，Globo H等結構，其中巖藻糖基化五糖m/z1086中主要成分為Type H antigen，雙巖藻糖基

7、化六糖m/z1260含有Lewis b與Lewisy，巖藻糖基化六糖m/z1290是Globo H；(2)三種肝癌細胞系中發(fā)現(xiàn)了和肝癌組織中類似的結果，均含異常糖基化鞘糖脂結構，如Globo H；(3)肝癌患者血清鞘糖脂的質譜表征發(fā)現(xiàn)有與肝細胞肝癌腫瘤組織相似的結果；(4)以糖組學的視角來分析結果發(fā)現(xiàn)，這些異常的巖藻糖基化鞘糖脂均含有相同的末端Fucɑ1-2Gal-結構域，其質譜表征圖與Fucɑ1-2Gal的標準品的質譜表征圖高度匹配，

8、從而證實了我們的結果；(4)巖藻糖基轉移酶 FUT1和 FUT2的檢測結果表明在不同的肝癌個體樣本中其表達情況是不同的，揭示FUT1和FUT2在不同肝癌病人中其負責Fucɑ1-2Gal-的合成能力會有差異。
　　結論：肝癌樣本中異常表達的巖藻糖基化結構含有H antigen，Globo H等多種的異常巖藻糖基化結構，揭示肝癌樣本中鞘糖脂的異常巖藻糖基化是復雜多變的，然而糖鏈組成的特點讓我們能夠從糖鏈本身的結構入手，找到異常巖藻糖基