槐糖脂合成的氮源代謝調控及槐糖脂的廉價底物生產(chǎn)和性質研究.pdf

1、表面活性劑是一類最重要的精細化工產(chǎn)品，廣泛應用于家庭、工業(yè)和農(nóng)業(yè)。幾乎每一種產(chǎn)品和人們生活的各個方面都離不開表面活性劑。隨著人們對環(huán)境問題認識的加深，從源頭上減少污染和治理污染的同時不產(chǎn)生二次污染已成為人們的共識，在這方面生物表面活性劑是未來表面活性劑的發(fā)展趨勢。由于槐糖脂具有高產(chǎn)量、生物可降解性，低毒性及良好的環(huán)境兼容性等優(yōu)點，可以應用于石油、環(huán)境保護、化妝品、洗滌劑、藥學領域及納米科技等工業(yè)領域，越來越引起人們的關注。因此槐糖脂被認

2、為是一種最有發(fā)展和應用潛力的、可能替代化學表面活性劑的可再生的生物表面活性劑，有著巨大的社會效應、經(jīng)濟效益和生態(tài)效益。
　　 本文的主要研究內容及結果如下:
　　 1.槐糖脂合成的氮源代謝調控研究
　　 國內外槐糖脂合成的代謝調控的相關研究主要集中在碳源對產(chǎn)槐糖脂菌株——Candidabombicola的影響，氮源對槐糖脂合成代謝的影響的相關研究則相對較少。本實驗室前期篩選得到一株槐糖脂高產(chǎn)菌株——擬威克酵母(W

3、ickerhamielladomercqiaevar.sophorolipidCGMCC1576)，本文則研究了氮源對W.domercqiae合成槐糖脂的影響。
　　 選取了十種氮源用于槐糖脂的發(fā)酵生產(chǎn)，結果發(fā)現(xiàn)有機氮源促進菌體生長，促進內酯型槐糖脂的合成;無機氮源抑制內酯型槐糖脂的合成，顯著降低內酯型槐糖脂占總槐糖脂的比例。培養(yǎng)基中無機氮源NH4+的濃度越高，發(fā)酵液pH值越低，內酯型槐糖脂的產(chǎn)量越低，內酯型槐糖脂在總槐糖脂中所

4、占的比例越低。發(fā)酵液的pH值和pH調節(jié)劑的種類均影響W.domercqiae生長及合成槐糖脂。pH調節(jié)劑C6H5O7Na3或NaOH可以提高發(fā)酵液的pH值以及增加菌體生物量和內酯型槐糖脂的產(chǎn)量;pH調節(jié)劑CaCO3可以提高發(fā)酵液的pH值卻使內酯型槐糖脂的產(chǎn)量顯著降低。以上結果表明，無機氮源通過改變發(fā)酵液的pH值，但不僅僅通過改變pH值影響槐糖脂的合成。
　　 利用TLC、IR及HPLC等色譜技術，比較了最具有代表性的有機氮源——

5、酵母粉和無機氮源——硫酸銨兩種條件下所得到的槐糖脂粗品的結構和組成的差異，并使用制備型HPLC、MS及GC-MS對硫酸銨條件下所得到的槐糖脂粗品中的主要組分進行了純化、制備和結構鑒定。
　　 2.利用新一代Solexa測序技術分析研究W.domercqiae在不同氮源條件下的基因表達差異
　　 目前沒有槐糖脂產(chǎn)生菌基因表達調控的相關研究，因此在全基因組水平研究氮源對W.domercqiae在轉錄水平的影響，有助于篩選差異

6、表達基因，深入了解槐糖脂合成通路相關基因的表達調控機理。
　　 首次利用基于新一代Solexa的數(shù)字化基因表達譜測序技術構建了W.domercqiae在酵母粉、硫酸銨兩種氮源培養(yǎng)條件下的兩個表達譜數(shù)據(jù)庫。酵母粉條件下總共得到了6，011，524條測序標簽，其中包括64，329種不同的標簽;硫酸銨條件下得到了72，375種5，886，784條測序標簽。兩個表達譜數(shù)據(jù)庫的比較結果顯示，表達倍數(shù)變化大于1的表達標簽共有4，291種，其

7、中，在酵母粉條件下上調(Ratio(YE/NS)＞1)的表達標簽有2，020種，下調(Ratio(YE/NS)＜1)的表達標簽2,271種。以FDR≤0.001且倍數(shù)差異在2倍以上作為顯著差異表達的標準，共得到顯著差異基因709種，其中硫酸銨條件下顯著上調的表達標簽392種，顯著下調的表達標簽317種。
　　 將表達標簽與W.domercqiae的全基因組數(shù)據(jù)進行比對，結果顯示，96％以上的表達標簽能夠比對到來源于W.domer

8、cqiae的參考基因上。數(shù)據(jù)庫YE和NS中分別有70.73％和67.73％的表達標簽比對到參考基因上。分析比較比對后的表達譜數(shù)據(jù)庫中的顯著差異基因發(fā)現(xiàn)，在酵母粉條件下，參與槐糖脂合成途徑的11個相關基因(如葡萄糖基轉移酶、乙?；D移酶及酯酶或脂肪酶等)顯著上調;而在硫酸銨條件下，僅有2個參與槐糖脂合成途徑的酯酶或脂肪酶基因顯著上調。由于沒有發(fā)現(xiàn)催化內酯化反應的內酯化酶基因的存在，而酯酶或脂肪酶具有催化酯化反應的能力，因此我們在全基因組范

9、圍內對編碼酯酶或脂肪酶的基因進行了篩選，共得到了27種有差異的編碼酯酶或脂肪酶的基因，為后續(xù)利用基因工程手段構建基因工程菌提供了有價值的參考。
　　 3.不同結構槐糖脂的表面活性和生物活性比較研究
　　 槐糖脂是酵母菌分泌的，由多種槐糖脂分子組成的混合物。不同種類和結構的槐糖脂分子具有不同的理化活性和生物活性，可以應用于不同領域。
　　 使用制備型HPLC制備得到了W.domercqiae利用油酸為第二碳源發(fā)酵所

10、得的槐糖脂粗品中的6種主要組分，并用MS和GC-MS分析了這6種槐糖脂純品的結構。結果發(fā)現(xiàn)他們的結構的區(qū)別在于槐糖部分乙?；潭鹊牟煌?一個乙?；騼蓚€乙?；?，脂肪酸部分碳鏈長度(16碳或18碳)和不飽和度(兩個雙鍵或一個雙鍵)的不同以及是否內酯化(酸型或內酯型)。研究了不同結構的槐糖脂純品的理化性質和生物活性，發(fā)現(xiàn)槐糖脂分子的乙酰化程度、脂肪酸部分的碳鏈長度和不飽和度以及是否內酯化都會影響其表面活性、乳化能力、細胞毒性和生物可降解性

11、。
　　 4.脫木素木糖渣制備槐糖脂合成底物的研究
　　 生產(chǎn)成本較高是槐糖脂目前還處于實驗室研究階段，尚未進行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)和走向市場的主要原因。為了降低槐糖脂的生產(chǎn)成本，我們開展了以纖維素原料——脫木素木糖渣(DCCR)為底物進行槐糖脂生產(chǎn)所需親水性碳源(脫木素木糖渣糖化液中所含的葡萄糖)、疏水性碳源(單細胞油)及氮源(單細胞蛋白)的制備的相關研究。
　　 考察了相同濾紙酶活添加量的3種商品纖維素酶(KD

12、N酶液、JNK酶液和Al0酶粉)在3種糖化緩沖體系(pH4.8的H2O、0.05MpH4.8HAc-NaAc緩沖液及0.2MpH4.8HAc-NaAc緩沖液)中酶解DCCR的效果，綜合考慮后，確定KDN酶液為DCCR糖化的最優(yōu)纖維素酶液。
　　 考察了產(chǎn)油酵母——CryptococcuscurvatusATCC96219在不同脫木素木糖渣水解液(DCCRH)及脫毒后DCCRH中的生長和產(chǎn)油情況。發(fā)現(xiàn)C.curvatus在未經(jīng)脫毒

13、處理的pH4.8的H2O和0.05M的HAc-NaAcDCCRH中可以正常生長，菌體干重分別達到了17.86g/l和15.32g/l，油脂含量分別為27.44％和40.21％。而在未經(jīng)脫毒處理的0.2MHAc-NaAcDCCRH中不能生長。經(jīng)脫毒處理后，C.curvatus在三種糖化液中均可以正常生長，菌體干重分別達到了10.57g/l，20.49g/l和17.36g/l，油脂含量也提高至22.13％，46.74％和44.35％。用GC

14、-MS對所得油脂的脂肪酸組成進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)其脂肪酸組成差別不大，均與植物油類似，以棕櫚酸、油酸和硬脂酸為主。
　　 通過正交實驗設計和進一步優(yōu)化確定了C.curvatus的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方，研究并比較了在最優(yōu)配方下，C.curvatus在經(jīng)不同脫毒處理后的DCCRH中的生長和產(chǎn)油情況，確定了含有5.0g/l酵母粉和20.0ml/l無機鹽溶液的活性炭吸附后的0.05MHAC-NaAcDCCRH為最優(yōu)的C.curvatus細

15、胞生長和積累油脂的培養(yǎng)基，在此條件下，單細胞油產(chǎn)量和油脂系數(shù)分別達到了10.94g/l和55.41％。高壓破碎發(fā)酵完成后所得C.curvatus菌體細胞，細胞破碎液中所含細胞碎片和油脂可以用作槐糖脂合成所需氮源和部分疏水性碳源。
　　 5.脫木素木糖渣生產(chǎn)槐糖脂的研究
　　 考察了不同糖化緩沖體系和脫毒處理方法對W.domercqiae生長和產(chǎn)槐糖脂的影響。發(fā)現(xiàn)當用KDN纖維素酶液在0.2MHAC-NaAc緩沖液中酶解D

16、CCR所得水解液進行槐糖脂的發(fā)酵時，槐糖脂的產(chǎn)量最高;活性炭吸附(C)處理水解液可以進一步提高槐糖脂的產(chǎn)量，因此在后續(xù)實驗中，選擇使用上述DCCRH進行槐糖脂的合成的相關研究。
　　 以經(jīng)活性炭吸附處理后的水解液為底物，優(yōu)化了W.domercqiae利用DCCRH和油酸產(chǎn)槐糖脂的培養(yǎng)基配方，確定了糖化液培養(yǎng)基中最優(yōu)酵母粉濃度和葡萄糖總濃度分別為1.5g/l和60.0g/l。
　　 在1.5L發(fā)酵罐中考察了補加葡萄糖、控制

17、pH和補加菜籽油對W.domercqiae利用DCCRH和菜籽油產(chǎn)槐糖脂的影響，并對不同條件下所得槐糖脂的組成進行了HPLC分析。考察了W.domercqiae利用DCCR水解液和單細胞油以及利用DCCR水解液和細胞破碎液合成槐糖脂的能力。結果顯示，W.domercqiae可以利用DCCRH和單細胞油合成槐糖脂，糖化液的脫毒處理可以提高內酯型、總槐糖脂的產(chǎn)量和內酯型槐糖脂占總槐糖脂的比例。在未處理和脫毒處理后的DCCRH培養(yǎng)基中，總槐糖